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18. Utilização da genética mendeliana para o estudo dos genes eucarióticos

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Utilização da genética mendeliana para o estudo dos genes eucarióticos

Ligação – o desenvolvimento do mapeamento gênico • Mapeamento gênico com eucariontes microbianos – o ciclo de vida da levedura – realizando um cruzamento com

S. cerevisiae – mapeamento de genes em S. cerevisiae • Levando a genética mendeliana além do mapeamento gênico – fenótipos complexos

A redescoberta das experiências de Mendel em 1900 deu

à nova geração de geneticistas provas conclusivas de que a herança poderia ser estudada de uma maneira científica. Este fato estimulou uma explosão de atividades, e os dez anos seguintes foram testemunha de importantes desenvolvimentos construídos sobre o trabalho de

Mendel e que interpretaram-no em termos de novas idéias para a biologia. Gradualmente, o poder dos cruzamentos genéticos se tornou aparente.

O desenvolvimento mais importante foi a proposição, feita por Sutton, em 1903, de que os genes residem nos cromossomos. Este fato imediatamente levantou a questão acerca da segunda Lei de Mendel sobre a segregação independente, pois pôde-se compreender que o número de cromossomos que um organismo possui precisa ser consideravelmente menor do que o número total de traços herdáveis demonstrados pelo organismo. Sendo assim, um único cromossomo precisa transportar um grande número de genes, e genes diferentes no mesmo cromossomo não seriam herdados independentemente mas, em vez disso, seriam transmitidos juntos; isto é, eles demonstrariam ligação. Esta apreciação clara do conceito de ligação levou diretamente às técnicas para o mapeamento de genes nos cromossomos eucarióticos, técnicas que hoje em dia ainda formam uma das pedras angulares da genética molecular.

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17. O que Mendel descobriu

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O Que Mendel descobriu

O estudo científico da hereditariedade – os cruzamentos monoíbridos – cruzamentos envolvendo dois pares de características • De que forma a genética molecular se relaciona com Mendel – pares de alelos – dominância e recessividade – explicações moleculares para as leis de Mendel

A contribuição de Mendel para a biologia nunca poderá ser superenfatizada, e não é por causa de romantismo ou nostalgia que seu nome ainda é reverenciado por geneticistas moleculares. A partir dos resultados de uma série de experiências diretas, embora árduas, Mendel foi capaz de deduzir dois princípios* fundamentais da Genética, os quais hoje em dia ainda reconhecemos como contendo as bases subjacentes da herança e da atividade gênica. A redescoberta do trabalho de Mendel e a aceitação dos seus resultados levaram ao estabelecimento da genética como um componente central da biologia do século XX. Além disso, a abordagem experimental de Mendel forma a base para técnicas mais sofisticadas desenvolvidas por

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5. Transcrição

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Transcrição

Eucariontes e procariontes • Seqüências de nucleotídeos •

Síntese do RNA – RNA polimerases • Transcrição em E. coli – iniciação – alongamento – término • Transcrição em eucariontes

Durante o primeiro estágio da expressão gênica, o filamento molde do DNA orienta a síntese de um filamento complementar de RNA. Este processo é chamado de transcrição e a molécula de RNA que é sintetizada, transcrito. Neste capítulo, veremos as reações químicas envolvidas na síntese de RNA, as enzimas que catalisam a reação e os eventos envolvidos no processo geral de transcrição. Primeiramente, entretanto, precisamos considerar dois importantes pontos gerais quanto às distinções entre organismos superiores e inferiores e à notação usada para descrever a seqüência de nucleotídeos de um gene.

de bactérias. A terminologia mais correta para este fim

é eucarionte e procarionte.

Os eucariontes e os procariontes são distintos por suas organizações celulares fundamentalmente diferentes (Fig. 5.1). A célula eucariótica típica é geralmente maior e mais complexa do que a procariótica, com um núcleo delimitado por uma membrana contendo os cromossomos, e com outras organelas membranares distintas, tais como mitocôndrias, vesículas e complexo de Golgi. Os procariontes, em contrapartida, não têm uma arquitetura celular extensa: as organelas membranares estão ausentes, e o material genético não está delimitado por uma estrutura distinta.

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21. Estudo de genes clonados

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Estudo de genes clonados

Identificação de um gene em uma biblioteca genômica – sondas de hibridização – bibliotecas de cDNA • Seqüenciamento do DNA – método de Sanger-Coulson – conquistas do seqüenciamento da DNA • Estudo da expressão gênica – análise do transcrito – estudo da regulação gênica • Identificação e estudo da proteína codificada por um gene clonado – HRT e HART – mutagênese in vitro • Genes clonados na biotecnologia – bactérias como hospedeiros para síntese de proteínas recombinantes – síntese de proteínas recombinantes nos eucariontes

Uma vez que um gene tenha sido clonado, quase não há limites para as informações que podem ser obtidas sobre sua estrutura e expressão. O desenvolvimento das técnicas de clonagem de genes, na década de 70, estimulou o desenvolvimento paralelo de métodos analíticos para o estudo de genes clonados, bem como foram introduzidas novas estratégias e métodos em intervalos regulares. Neste capítulo, veremos uma seleção dos mais importantes métodos e também encaminharemos os modos pelos quais os genes clonados estão sendo usados na indústria da biotecnologia. Em primeiro lugar, abordaremos o que, em geral, é o primeiro problema a surgir em um projeto de biologia molecular: como isolar de uma biblioteca genômica um clone que transporta o gene no qual você está interessado.

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19. Análise genética de bactérias

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Análise genética de bactérias

Características básicas do mapeamento gênico nas bactérias • Mapeamento de conjugação – a experiência de conjugação interrompida • Mapeamento através da transdução • Mapeamento por transformação • Méritos relativos dos três métodos

É bastante surpreendente que, a despeito do estabelecimento por Morgan e seus colaboradores das técnicas de análise genética de aplicabilidade geral aos organismos eucarióticos, muito poucos biologistas durante as primeiras décadas do século tentaram desenvolver procedimentos análogos para o estudo dos genes bacterianos. De fato, até 1940, um número significativo de biólogos não estava nem mesmo convencido de que as bactérias realmente possuíam genes, mas, em vez disso, eles ainda retinham traços do temor característico do século XIX com relação aos processos biológicos e consideravam que certos fenômenos simplesmente não poderiam ser revelados através da metodologia científica.

A primeira pessoa responsável por colocar a análise genética das bactérias no mesmo nível da de eucariontes foi Joshua Lederberg (Cap. 14). A primeira contribuição de Lederberg foi a demonstração, em

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15. Genomas Eucarióticos

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Genomas eucarióticos

Organização genética do genoma nuclear – conteúdos gênicos – tamanhos

– DNA de cópia única e repetitivo • Organização física – compactação do DNA em cromossomos – morfologia cromossômica • Replicação do DNA e multiplicação celular – o ciclo celular • Genes extracromossômicos

– sistemas genéticos organelares – genomas organelares

Os dois capítulos seguintes envolvem os genomas eucarióticos. Neste capítulo, faremos um amplo levantamento de genes e genomas em todos os eucariontes, nos concentrando principalmente em tópicos que são de importância geral. Veremos a organização genética dos genomas eucarióticos, o modo pelo qual o genoma é compactado nos cromossomos, como eles se replicam, e as características especiais das moléculas de DNA presentes nas mitocôndrias e nos cloroplastos. No Cap. 16, faremos um exame mais detalhado do genoma humano.

Antes de começar, é importante perceber que a célula eucariótica pode ter até três sistemas genéticos distintos. Quando Sutton propôs, em 1903, que os genes de organismos superiores residem em estruturas chamadas cromossomos, ele estava obviamente correto,

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9. Tradução

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Tradução

O papel do tRNA – aminoacilação – reconhecimento do códon • Mecanismo da síntese proteica na E. coli – iniciação – alongamento – finalização • Tradução nos eucariontes

O código genético é utilizado durante a etapa final da expressão gênica, quando moléculas de RNA são traduzidas em polipeptídeos. A tradução é bastante complexa e envolve muitos componentes diferentes da célula. Entretanto, a obediência ao código genético é fundamental para o processo como um todo e

é assegurada pelas moléculas de tRNA que atuam como adaptadores, formando um elo físico e informacional entre a seqüência de nucleotídeos do mRNA e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo

(Fig. 9.1). Neste capítulo, veremos com detalhes o mecanismo pelo qual as proteínas são sintetizadas na célula. Primeiramente, entretanto, precisamos “atacar” uma questão mais fundamental: de que maneira exatamente tRNAs são capazes de assegurar que a tradução ocorra de acordo com as regras do código genético.

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3. A estrutura do DNA

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A estrutura do DNA

O DNA é um polímero – nucleotídeos – polinucleotídeos – RNA • A dupla hélice – pareamento de bases complementares – formas diferentes de DNA

Agora que já sabemos que os genes são feitos de DNA, precisamos estabelecer exatamente como é formada a sua estrutura e de que maneira ela se relaciona com as propriedades e necessidades do material genético.

Alguns estudantes julgam o estudo das estruturas moleculares um dos aspectos mais enfadonhos da biologia, mas, quando se trata de DNA, deve-se fazer um esforço a fim de compreender e memorizar sua estrutura. A resposta para o enigma de Schrödinger “O que é a vida” está contida na molécula de DNA.

tadores da energia utilizada para ativar muitas reações enzimáticas.

O nucleotídeo é, por si só, uma molécula bastante complexa, sendo constituído de três componentes distintos: um açúcar, uma base nitrogenada e ácido fosfórico (Fig. 3.2).

(a) o açúcar (ou ose)

No DNA, o açúcar do nucleotídeo é uma pentose (que contém 5 átomos de carbono) chamada 2Ј-desoxirribose (Fig. 3.2(a)). As pentoses podem existir sob duas formas: a cadeia linear, ou estrutura de Fischer, e a

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13. Vírus — as formas mais simples de vida

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Vírus — as formas mais simples de vida

Bacteriófagos • genomas • ciclos de vida • organização e expressão gênica

• Vírus de eucariontes • estruturas e ciclos da infecção • estratégias de replicação • o vírus da AIDS • retrovírus e câncer

Os vírus são as primeiras e mais simples formas de vida que iremos investigar. Na verdade, os vírus são tão simples em termos biológicos que temos que nos perguntar se realmente podem ser considerados organismos vivos. As dúvidas surgem, em parte, porque os vírus seguem linhas diferentes das outras formas de vida — os vírus não são células – e, em parte, devido à natureza do ciclo de vida viral. Eles são parasitos permanentes do tipo mais extremo: somente se reproduzem dentro da célula hospedeira e, para expressar e replicar seus genes, precisam subverter pelo menos parte do mecanismo genético hospedeiro de acordo com seus propósitos. Alguns vírus possuem genes que codificam suas próprias RNA e DNA polimerases, porém muitos dependem das enzimas do hospedeiro para a replicação do DNA e a transcrição. Todos os vírus fazem uso dos ribossomos e do mecanismo de tradução do hospedeiro para a síntese dos polipeptídeos que constituem os revestimentos proteicos de sua prole. Isto significa que os genes virais precisam estar em contato com o sistema genético do hospedeiro. Os vírus são, portanto, bastante específicos para determinados organismos, e certos tipos não podem infectar um amplo espectro de espécies.

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12. Alterações no material genético

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Alterações no material genético

Mutações – tipos diferentes – reversão do efeito de uma mutação – mutágenos • Reparo do DNA • Recombinação – recombinação generalizada – papel da recombinação na genética

Embora a replicação do DNA ocorra virtualmente sem erros, ocasionalmente eles ocorrem. Um erro na replicação resulta em uma molécula filha que contém um mau pareamento, uma posição na qual um par de bases não se forma, pois os nucleotídeos opostos em cada filamento da dupla hélice não são complementares (Fig. 12.1(a)). Quando a molécula filha mal pareada se replica, as duas moléculas netas produzidas não são idênticas: uma tem a seqüência correta de nucleotídeos, mas a segunda contém uma mutação.

Uma mutação é simplesmente uma alteração na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de DNA.

As mutações também são causadas por mutágenos químicos e físicos. Várias substâncias químicas reagem com as moléculas de DNA e mudam a estrutura de um ou mais nucleotídeos dentro da dupla hélice. O calor, a radiação ultravioleta e outros mutágenos físicos têm efeitos similares. A mudança na estrutura de um nucleotídeo pode afetar suas propriedades de pareamento de bases, resultando em uma mutação quando a molécula de DNA se replica (Fig. 12.1(b)).

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6. Tipos de RNA: rRNA e tRNA

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Tipos de moléculas de RNA: rRNA e tRNA

RNA ribossomal – estrutura do ribossomo – síntese do rRNA • RNA transportador – o trevo – processamento e modificação

As moléculas de RNA produzidas por transcrição podem ser agrupadas em três classes principais de acordo com sua função: rRNA ou ribossomal, tRNA ou transportador, e mRNA ou mensageiro. Os

RNAs ribossomal e transportador são os produtos finais da expressão gênica e desempenham seus papéis na célula como moléculas de RNA (Fig. 6.1). O RNA mensageiro, por outro lado, passa pelo segundo estágio da expressão gênica, a tradução, e não possui utilidade a não ser a de atuar como intermediário entre um gene e seu produto final da expressão — um polipeptídeo.

Os RNAs ribossomal e transportador por vezes são chamados RNA estável, o que indica que estas moléculas possuem vida longa na célula, ao contrário do mRNA que tem uma taxa de turnover relativamente

Gene de rRNA

Gene de tRNA

Molécula de mRNA

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1. As origens da genética e da biologia molecular

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As origens da genética e da biologia molecular

Mendel • O nascimento da genética • Genes, cromossomos e a mosca das frutas

• O que é a vida?

Genética é o nome dado ao estudo da hereditariedade, o processo pelo qual as características são passadas dos genitores para a prole de modo que todos os organismos, inclusive os seres humanos, se assemelhem a seus ancestrais. O conceito central da genética é que a hereditariedade é controlada por um grande número de fatores, os genes, que são pequenas partículas físicas presentes em todos os organismos vivos.

Os primeiros geneticistas estavam interessados principalmente em como os genes são transmitidos dos genitores para a sua prole durante a reprodução e em como diferentes genes atuam juntos para controlar características variáveis, tais como altura e cor dos olhos. Durante a década de 1930, a pesquisa tomou novos rumos ao reconhecer que se os genes são entidades físicas, eles, como outros componentes da célula, devem ser feitos de moléculas e, portanto, deve ser possível estudá-los diretamente por métodos biofísicos e bioquímicos. Isso levou a um novo ramo da genética, chamado biologia molecular, que tinha como um de seus objetivos iniciais a identificação da natureza química do gene. Este novo enfoque levou a novos conceitos e logo os biólogos deixaram de considerar os genes individuais simplesmente como unidades de herança, passando a encará-los como unidades de informação biológica, com todo o complemento de genes de um organismo possuindo a quantidade total de informações necessárias para a construção de um exemplo vivo e funcional daquele organismo. O objetivo dos geneticistas e biólogos moleculares durante os últimos 50 anos tem sido compreender o modo pelo qual a informação biológica é armazenada nos

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Respostas de Problemas selecionados e Glossário

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Respostas de problemas selecionados

Cap. 3

Cap. 6

15. 5Ј-TTGCATTGCTAT-3Ј

16. (a) 30%

(b) 40%

(c) 20%

(d) 20%

17. 54%

11.

Braço aceptor

Cap. 4

12. 495

13. 29 de 36 a 81%

14. 5Ј-AUGGGUACUAAAGGGCGCUAUAUAUACGGACGUUAG-3Ј

5Ј-AUGGGAACCAAAGCGCGCUACAUAUAUGGUCCUUAG-3Ј

Braço T␺C

Braço DHU

Cap. 5

12. As seqüências podem ser resumidas do seguinte modo:

1.o nucleotídeo

6 As

1T

2.o nucleotídeo

6 Ts

1G

3.o nucleotídeo

6 As

1T

12.

5 Gs

1C

1A

4.o nucleotídeo

5.o nucleotídeo

6 As

1C

6.o nucleotídeo

5 Cs

1G

1T o

6 As

1T

7. nucleotídeo

8.o nucleotídeo

6 Ts

1A

9.o nucleotídeo

4 As

3 Ts

Assim, a seqüência de consenso seria 5Ј-ATAGA

ACAT -3Ј. Apenas o último nucleotídeo é duT

13. vidoso.

13. Todas elas

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22. Seqüenciamento de genomas inteiros

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Seqüenciamento de genomas inteiros

Por que seqüenciar um genoma? • Estratégias para o seqüenciamento de genomas – pequenos genomas bacterianos – o genoma de S. cerevisiae – o genoma humano • Além dos projetos de genomas

• A genética no século 21

Os avanços mais significativos na genética durante a década de 1990 vieram da publicação de seqüências completas para cromossomos e genomas inteiros. O primeiro cromossomo eucariótico a ser totalmente seqüenciado foi o cromossomo III de Saccharomyces cerevisiae, publicado em 1992. Isto foi seguido, em

1995, pela primeira seqüência genômica completa de um organismo de vida livre, a bactéria Haemophilus influenzae, e a primeira seqüência completa de um genoma eucariótico, novamente S. cerevisiae, em

1996. Uma variedade de outros projetos genômicos estão a caminho (por exemplo, o Projeto do Genoma

Humano, outros mais de Drosophila, do arroz, e de camundongo), e o número de seqüências completas deverá aumentar muito na próxima década. De fato, no ano 2010 é possível que uma seqüência genômica completa seja considerada um pré-requisito para qualquer estudo genético sério com um organismo, e os biólogos moleculares do futuro talvez se espantem e se questionem como fizemos progressos na compreensão dos genes na época antecedente ao seqüenciamento do genoma.

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16. O Genoma Humano

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O genoma humano

Estrutura do genoma humano – genes e famílias de genes – DNA extragênico – semelhanças entre os genomas humano e de macacos • Origens genéticas das populações humanas modernas – polimorfismos no genoma humano

• O Projeto do Genoma Humano

Livros inteiros têm sido escritos sobre o genoma humano. Ao nos restringirmos a um único capítulo, inevitavelmente teremos que ser seletivos quanto ao que abordar, mas o exercício ainda vale a pena por dois motivos. Primeiro, ele permite que examinemos em mais detalhes os componentes importantes de um genoma eucariótico típico, em particular a fração mensurável que não tem função codificante. Segundo, ele nos leva aos aspectos aplicados dos estudos dos genomas, mostrando como o desenvolvimento de nossos conhecimentos sobre o genoma humano está sendo utilizado em áreas mais amplas da biologia humana.

16.1 A estrutura do genoma humano

Quadro 16.1 Tamanhos das moléculas de DNA em cromossomos humanos

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