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7. Estudando Genes

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Estudando Genes

Momento de descoberta

Meu laboratório na SUNY Stony Brook estudava a variação genética nos genes ribossomais de camundongos em épocas anteriores ao sequenciamento genômico ou mesmo antes de se poder prontamente sintetizar oligonucleotídeos de DNA. Utilizando o método de Ed Southern para hibridização de fragmentos curtos de DNA com sequências complementares de amostras de DNA genômico, fizemos mapas de restrição enzimática do DNA ribossomal humano e de camundongo.

Norman Arnheim [Fonte: Cortesia da

Meus alunos tomaram emprestado

University of Southern California.] marcadores de tamanho de DNA de fago lambda do meu colega Ken Marcu para usar nos experimentos de Southern blotting com o DNA de camundongo e humano.

Logo começaram a me falar sobre uma determinada sequência de uma sonda da região de um gene ribossomal de camundongo que estava dando sinal em um fragmento de

DNA específico do fago lambda. Ainda posso me ver parado no laboratório, observando aqueles Southern blots mostrarem o fragmento de lambda, mas sabendo que não poderia ser o DNA de lambda que era complementar à sequência do camundongo! Então, o que estava acontecendo?

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9. Topologia: Deformações Funcionais do DNA

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Topologia: Deformações

Funcionais do DNA

Momento de descoberta

Existia um experimento que eu desejava fazer há muitos anos, mas nunca tinha convencido ninguém a tentar realizá-lo. A ideia era medir diretamente as propriedades elásticas do DNA usando uma única molécula sua presa entre duas ponteiras, de modo que pudesse ser delicadamente controlada pela rotação de uma ponteira com relação à outra para torcer o DNA de diferentes maneiras. Em solução, o DNA pode rotar ao longo do seu eixo e se torcer, enrolando-se ao redor de si.

Pode ser muito difícil desfazer as rotações e torções, medindo as propriedades do DNA em grandes quantidades.

Carlos Bustamante [Fonte: Cortesia de

Após a negativa de muitos estudantes,

Carlos Bustamante.] afinal dois alunos, Zev Bryant e Michael

Stone, ficaram interessados em realizar os experimentos sobre as rotações do DNA. Esses rapazes trabalharam intensivamente na tentativa de estabelecer os aspectos técnicos do experimento. Descobriram como prender as extremidades de um fragmento de DNA a duas ponteiras opostas e associaram pequenas contas facilmente visualizáveis em uma posição no interior da fita dupla de DNA. Por fim, tarde de uma noite, conseguiram fazer tudo funcionar. Zev e

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15. Síntese de RNA Dependente de DNA

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Síntese de RNA

Dependente de DNA

Momento de descoberta

No início da década de 1980, ficou claro que deveriam existir proteínas especializadas na síntese precisa e regulada de mRNAs para determinados genes em células de mamíferos. Entretanto, ninguém havia sido capaz de identificar tais “fatores de transcrição” ou determinar como esse processo de ativação da transcrição atuava.

A descoberta em meu laboratório ocorreu quando constatamos que extratos de células humanas continham um fator capaz de discriminar entre dois moldes e de alguma forma programar a enzima que lê o DNA para escolher o promotor adequado e igRobert Tjian [Fonte: Bonnie Azab/UC norar todos os outros. Mas como?

Berkeley.]

Decidimos usar um pequeno pedaço da sequência de DNA do promotor ativo como “isca” para pescar proteínas que se ligam de maneira seletiva a este sítio. O desafio foi purificar essa atividade entre outras ~3.000 proteínas ligadoras de DNA presentes no extrato de células humanas! Após meses de luta com este problema, lembro-me muito bem de estar entrando no laboratório e ouvindo meus colaboradores, Jim

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11. Replicação do DNA

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Replicação do DNA

Momento de descoberta

Iniciei meu laboratório em Stanford para estudar a recombinação de DNA utilizando os métodos bioquímicos estabelecidos por Arthur Kornberg para o trabalho com a DNA-polimerase. O laboratório de Matt

Meselson em Harvard apresentou evidência de que a recombinação de DNA envolvia a quebra e junção de suas fitas. Partimos, então, para a tentativa de descobrir uma enzima que selasse a quebra do DNA pela formação de uma ponte fosfodiéster.

Usando extratos celulares de E. coli e um substrato de duplex de DNA contendo quebras de fita simples

Robert Lehman [Fonte: marcadas com 32P nas porções 5'-terminais, medimos

Cortesia da American Society for Biochemistry and Molecular a conversão de 5'-32P para uma forma que fosse proBiology.] tegida da remoção por uma enzima, presumivelmente devido à incorporação em uma nova ponte fosfodiéster. Esse ensaio funcionou, e as fitas de DNA foram unidas após incubação do extrato!

No entanto, eu queria obter uma prova definitiva de que as fitas eram unidas por uma ponte fosfodiéster. Apesar de parecer óbvio agora, à época pensamos na possibilidade de que uma proteína ligante fosse a causa da união das fitas de DNA.

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5. Função Proteica

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Função Proteica

Momento de descoberta

Um dos meus primeiros momentos “eureca” ocorreu durante os anos em que fui professor-assistente. Estávamos estudando em meu laboratório as propriedades de ligação ao DNA da proteína tetramérica de ligação ao DNA de fita simples (SSB, do inglês single-stranded DNA-binding) de Escherichia coli, que é um componente central dos processos de replicação, recombinação e reparo do DNA. Estimativas anteriores do tamanho do seu sítio de oclusão (a extensão de DNA com a qual a proteína interaTim Lohman [Fonte: Cortesia ge diretamente) quando ligado ao DNA de Timothy Lohman.] simples fita variavam de ~30 a 77 nucleotídeos. Não havia consenso para o valor

“correto” e nenhuma explicação do porquê da amplitude desse intervalo de extensão.

Les Overman, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, e eu notamos que o tamanho medido variava tanto com a concentração de sal (p. ex., NaCl) quanto com o tipo de sal, mas atingia um valor limite de ~33 e ~65 nucleotídeos por tetrâmero, em concentrações baixas e altas de sal, respectivamente. Com base nesses experimentos, criamos as hipóteses de que o tetrâmero SSB poderia se ligar ao DNA de fita simples pelo menos de duas maneiras distintas, uma sugestão inédita até aquele momento e que também foi proposta ao mesmo tempo por experimentos independentes realizados no laboratório de Jack Griffith. Recordo da excitação no laboratório quando analisamos nossos resultados, uma vez que eles também explicavam as aparentes discrepâncias no grande volume de dados existentes, provenientes de diversos laboratórios.

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