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Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

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O trabalho de laboratório de Bioquímica e Biofísica é uma das mais importantes atividades dos estudantes dessas ciências. Essa tarefa os coloca frente a uma situação prática, de execução dos conhecimentos que adquiriram nas aulas teóricas: é a ocasião em que aprendem as habilidades de que irão necessitar quando forem exercer a profissão que escolheram.
Este livro, que preenche um grande hiato da literatura acadêmica, foi concebido justamente para colocar à disposição dos estudantes um conjunto de conhecimentos práticos necessários para a compreensão das disciplinas de Bioquímica e Biofísica, reforçando seus conhecimentos e preparando-os para a vida profissional.
Os temas abordados foram selecionados para atender aos currículos da maioria dos cursos da área de ciências biológicas e da saúde. Cada atividade prática é embasada em considerações teóricas, e o texto contempla os objetivos, os materiais e métodos, os resultados e as conclusões relativos a ela.

 

23 capítulos

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1 - Instrumentação para Uso do Laboratório em Atividades de Bioquímica e Biofísica

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1

Instrumentação para

Uso do Laboratório em Atividades de

Bioquímica e Biofísica

Introdução, 2

XX

Normas gerais de segurança no laboratório, 2

XX

Principais materiais e equipamentos utilizados nas atividades práticas propostas, 3

XX

Vidrarias, 4

Outros materiais, 6

Equipamentos, 7

Atividade prática: instrumentação para uso do laboratório, 8

XX

Objetivo, 8

Materiais e método, 8

Resultados e conclusão, 9

Questões, 9

XX

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2

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Todo trabalho de laboratório passa por quatro fases:

1. Familiarização do estudante com o ambiente do laboratório.

2. Desenvolvimento de habilidades para o uso de aparelhos.

3. Execução do experimento proposto visando aos resultados finais.

4. Interpretação dos resultados obtidos.

 

2 - Eletroforese de Proteínas

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2

Eletroforese de

Proteínas

Introdução, 12

XX

Fundamentação teórica, 12

Proteínas do soro, 13

Atividade prática: eletroforese de proteínas do soro, 14

XX

Objetivo, 14

Materiais e método, 14

Resultados e conclusão, 15

Densitograma de pro­teí­nas plasmáticas. Aspectos quantitativos, 16

Questões, 17

XX

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12

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

As soluções biológicas, além do solvente água, possuem uma enorme variedade de componentes. O estudo da composição qualitativa e quantitativa dessas soluções pode ser feito por meio de métodos biofísicos que possibilitem separar e identificar esses componentes. A eletroforese é um dos métodos biofísicos de estudo das soluções e consiste na separação dos componentes de um sistema pela aplicação de um campo elétrico. É um dos métodos mais usados no laboratório, tanto na forma fundamental como nas variantes.

 

3 - Eletroforese de Hemoglobinas

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3

Eletroforese de

Hemoglobinas

Introdução, 20

XX

Atividade prática: eletroforese de hemoglobinas, 21

XX

Objetivo, 21

Materiais e método, 21

Resultados e conclusão, 24

Questões, 26

XX

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20

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

A hemoglobina, pigmento vermelho das hemácias, é uma pro­teí­na conjugada que tem como grupo prostético a ferroprotoporfirina, chamada heme, e que constitui 4% da molécula.

Os 96% restantes são formados por uma pro­teí­na básica, uma histona denominada globina.

A função da hemoglobina é o transporte de oxigênio, e esta função está intimamente ligada a sua estrutura, que por sua vez é determinada pela se­quên­cia, número e tipos de aminoácidos que a constituem.

Existem várias globinas normais diferentes: α, β, γ e δ (alfa, beta, gama e delta); além destas, uma cadeia embrionária ε (épsilon) está presente durante os três primeiros meses de vida fetal. Desde que cada unidade funcionante de hemoglobina é constituída de quatro cadeias, as seguintes combinações são possíveis:

 

4 - Lipoproteinograma

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4

Lipoproteinograma

Introdução, 28

XX

Atividade prática: lipoproteinograma, 30

XX

Objetivos, 30

Materiais e método, 30

Resultados e conclusão, 31

Questões, 33

XX

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28

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

As lipoproteínas são associações entre lipídios e proteínas denominadas apolipoproteínas

(apos). As apos têm diversas funções no metabolismo das lipoproteínas, como a formação intracelular das partículas lipoproteicas (p. ex., apos B100 e B48), atuação como ligantes a receptores de membrana (p. ex., apos B100 e E) ou como cofatores enzimáticos (p. ex., apos CII, CIII e AI). As lipoproteínas possuem a função de transportar os lipídios no plasma

(triglicerídeos e colesterol) dos seus locais de origem — do intestino (exógena) e do fígado

(endógena) para os locais de armazenamento e utilização, uma vez que estes são insolúveis em água. A fração lipídica das lipoproteínas é muito variável, e permite a classificação das mesmas em quatro classes separadas em dois grupos, de acordo com sua densidades e sua mobilidade eletroforética.

 

5 - Espectrofotometria

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5

Espectrofotometria

Introdução, 36

XX

Natureza da cor, 36

Absorção de luz pela matéria e escolha do melhor comprimento de onda, 37

Lei de Lambert-Beer, 38

Desvios da Lei de Lambert-Beer, 39

Espectrofotômetro, 40

Espectro de absorção ou curva de absorção, 41

Curva de absorção para antipirilquinonimina, 41

Curva-padrão, curva de calibração ou curva de referência, 42

Atividade prática: espectrofotometria, 44

XX

Objetivo, 44

Materiais e método, 44

Resultados e conclusão, 45

Questões, 45

XX

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36

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. A maioria dos métodos utilizados em bioquímica clínica envolve a determinação espectrofotométrica de compostos corados (cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são específicos e muito sensíveis.

 

6 - Tampões

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6

Tampões

Introdução, 48

XX

Aspectos quantitativos, 49

Atividade prática: determinação da capacidade tamponante, 51

XX

Objetivos, 51

Materiais e método, 51

Resultados e conclusão, 52

Questões, 53

XX

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48

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

No que diz respeito a ácidos e bases, o conceito de Brönsted-Lowry é adequado ao estudo de pH e tampões, em que ácidos podem ser definidos como com­postos capazes de doar prótons hidrogênio e bases, estas capazes de aceitar prótons hidrogênio. Embora este conceito possa ser aplicado a sistemas aquosos e não aquosos, no caso de sistemas biológicos, considerando a presença da água, a ionização ocorre em meio aquoso.

Como a água é o componente mais abundante nos sistemas biológicos, é de esperar que ela e seus íons desempenhem papel muito importante nesses sistemas, e isso se verifica nos seres vivos. Nesse sentido, recordaremos o comportamento acidobásico da água que envolve a sua dissociação como um eletrólito muito fraco, pois sistemas biológicos ácidos e bases provenientes do metabolismo in­ter­me­diá­rio sofrem ionização ao interagir com a água, como doador ou aceptor de prótons hidrogênio.

 

7 - Dosagem de Proteínas Totais

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7

Dosagem de

Proteínas Totais

Introdução, 56

XX

Atividade prática: dosagem de proteínas totais, 56

XX

Objetivo, 56

Materiais e método, 56

Resultados e conclusão, 57

Valores de referência, 57

Questões, 58

XX

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56

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

As pro­teí­nas plasmáticas contribuem com cerca de 7% do plasma e são em geral divididas em três grupos: albumina, globulinas e fibrinogênio. A albumina representa 55% das pro­teí­nas plasmáticas, 38,5% para a globulina e 6,5% para o fibrinogênio.

A albumina presente no sangue exerce a função de regular a pressão osmótica. Se as pro­teí­nas plasmáticas diminuírem, principalmente albumina, a pressão osmótica do plasma diminui. Isto causa uma maior pressão para fora da terminação capilar e o fluido (água) acumu­la-se nos tecidos causando o edema. O edema também pode ocorrer em decorrência de doen­ças car­día­cas.

 

8 - Atividade Enzimática

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8

Atividade

Enzimática

Introdução, 60

XX

Atividade prática: efeito da temperatura e do pH na atividade enzimática, 65

XX

Objetivo, 65

Materiais e método, 65

Resultados e conclusão, 67

Questões, 69

XX

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60

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

As enzimas são pro­teí­nas que possuem atividade catalítica, portanto, possuem todas as características das pro­teí­nas. São denominadas catalisadores biológicos. Aceleram em média

109 a 1012 vezes a velocidade da reação transformando de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto por minuto de reação sem, no entanto, participar dela como reagente ou produto.

Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas. Atuam em concentrações muito baixas e estão quase sempre dentro da célula, e compartimentalizadas. As enzimas diferem dos catalisadores químicos em vários aspectos.

 

9 - Teste de Tolerância à Glicose

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9

Teste de Tolerância à

Glicose

Introdução, 72

XX

Teste de tolerância à glicose (TTG/TTOG/curva glicêmica), 73

Atividade prática: teste de tolerância à glicose, 74

XX

Objetivo, 74

Materiais e método, 74

Resultados e conclusão, 76

Questões, 76

XX

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72

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os produtos finais da digestão dos carboidratos no trato digestório consistem em glicose, frutose e galactose — representando em média 80% de glicose. Após sua absorção no trato digestório, grande parte da frutose e quase toda a galactose são convertidas em glicose no fígado, portanto, esta constitui a via final comum para o transporte dos carboidratos até as células te­ci­duais.

Logo após uma refeição, a concentração de glicose se eleva e dispara a liberação da insulina, sintetizada nas células β das ilhotas pancreáticas. O mecanismo de transporte de glicose por meio da membrana celular necessita de pro­teí­nas denominadas transportadores, que permitem a passagem da glicose do sangue para as células do organismo após um mecanismo de ligação da insulina a esses transportadores. Os transportadores (GLUT) são sistemas de transporte facilitado, pois levam a glicose para o seu gradiente de concentração.

 

10 - Dosagem de Colesterol

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10

Dosagem de

Colesterol

Introdução, 78

XX

Atividade prática: dosagem de colesterol, 79

XX

Objetivo, 79

Materiais e método, 79

Resultados e conclusão, 80

Valores de referência, 80

Causas de alterações no colesterol sérico, 81

Questões, 81

XX

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78

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

O colesterol, um esterol, exerce papel essencial na estrutura das membranas de todas as células do organismo, bem como é precursor dos hormônios esteroides, da vitamina D e dos

ácidos biliares.

A fórmula apresentada na Figura 10.1 mostra que o colesterol é um esterol com um radical alcoólico e que a cadeia carbonada ligada ao C17 confere ao composto uma solubilidade semelhante

à dos lipídios (solúvel em solventes orgânicos, tipo éter e clorofórmio).

O colesterol pode ser proveniente da dieta nos produtos de origem animal e sintetizado endogenamente a partir do composto simples com dois átomos de carbono (acetil-CoA). Praticamente todas as células humanas são capazes de produzir colesterol.

 

11 - Dosagem de HDL-colesterol

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11

Dosagem de

HDL-colesterol

Introdução, 84

XX

Atividade prática: determinação de HDL-colesterol, 84

XX

Objetivo, 84

Materiais e método, 85

Princípio, 85

Resultados e conclusão, 87

Questões, 88

XX

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84

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os lipídios são transportados no plasma sanguíneo nos complexos macromoleculares conhecidos como lipoproteínas, como visto no capítulo 4, onde foi abordada a eletroforese de lipoproteínas.

As lipopro­teí­nas têm propriedades físicas e químicas desiguais devido às diferenças de proporções de lipídios e pro­teí­nas nas suas constituições. As lipopro­teí­nas foram classificadas por ultracentrifugação, com base nas diferenças de densidade. Esta classificação inclui: quilomícrons, lipopro­teí­na de muito baixa densidade (VLDL), lipopro­teí­na de densidade in­ ter­me­diá­ria (IDL), lipopro­teí­na de baixa densidade (LDL), lipopro­teí­na de alta densidade (HDL).

 

12 - Dosagem de Triglicerídeos

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12

Dosagem de

Triglicerídeos

Introdução, 90

XX

Atividade prática: dosagem de triglicerídeos, 90

XX

Objetivo, 90

Materiais e método, 90

Resultados e conclusão, 93

Questões, 93

XX

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90

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os lipídios são componentes oleosos ou gordurosos, insolúveis em água, que podem ser extraídos por solventes polares. Alguns lipídios ­atuam como componentes estruturais das membranas e outros como meio de armazenamento de combustível.

Os ácidos graxos, que são os componentes gordurosos dos lipídios, em geral, possuem um número par de átomos de carbono; os mais abundantes possuem de 16 a 18 átomos de carbono.

Em bioquímica clínica devemos nos preocupar com os lipídios existentes no soro, no plasma e nas fezes. Os lipídios totais incluem o colesterol, os seus ésteres, os fosfolipídios, os triglicerídeos, pequenas quantidades de cerebrosídeos, ácidos graxos não esterificados,

 

13 - Transaminases

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13

Transaminases

Introdução, 96

XX

Atividade prática: dosagem de transaminases, 98

XX

Objetivo, 98

Materiais e método, 98

Resultados e conclusão, 101

Questões, 102

XX

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96

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os aminoácidos que não são utilizados de imediato para síntese de pro­teí­nas e outras biomoléculas não podem ser armazenados nas células, como ocorre com os ácidos graxos e a glicose, nem podem ser excretados. Assim, esses aminoácidos devem ser degradados. A degradação desses aminoácidos compreende a remoção e a excreção do grupo amino e a oxidação da cadeia carbônica (α-cetoácido) remanescente. O grupo amino é convertido em ureia e as cadeias carbônicas resultantes são convertidas a compostos comuns ao metabolismo de carboidratos e lipídios, ou seja, piruvato, acetil-CoA e in­ter­me­diá­rios do ciclo de Krebs (veja Figura 13.1).

 

14 - Dosagem de Ureia

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14

Dosagem de Ureia

Introdução, 104

XX

Atividade prática: dosagem de ureia, 105

XX

Objetivo, 105

Materiais e método, 105

Resultados e conclusão, 106

Questões, 106

XX

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104

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os compostos constituintes de nosso organismo não são permanentes, estão em constante síntese e degradação. No caso das pro­teí­nas, estima-se que para um adulto com uma dieta adequada haja uma renovação (turnover) de 400 g por dia. Os aminoácidos são a matériaprima para a síntese das pro­teí­nas em nosso organismo, estas podem ser provenientes da degradação de pro­teí­nas exógenas (dieta), pro­teí­nas endógenas, ou ainda sintetizadas pelo próprio organismo por meio de reações especiais carbônicas, são transformadas em compostos comuns ao metabolismo de carboidratos e lipídios.

Os seres vivos não são capazes de armazenar aminoácidos nem pro­teí­nas e, assim, atendidas as necessidades de síntese, os aminoácidos excedentes são degradados. A degradação dos aminoácidos compreende a remoção do grupo amino e a oxidação da cadeia carbônica remanescente (reação de desaminação). O grupo amino por desaminação dá origem à amônia que, em sua maioria, é convertida em ureia no fígado. As cadeias carbônicas são transformadas em compostos comuns ao metabolismo de carboidratos e lipídios (Figura 14.1).

 

15 - Coagulação Sanguínea

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15

Coagulação

Sanguínea

Introdução, 108

XX

Sobre a coagulação sanguínea, 108

Cascata da coagu­la­ção, 110

Fibrinólise, 112

Anticoagulantes, 113

Atividade prática: fatores que interferem na coagulação sanguínea , 114

XX

Objetivos, 114

Materiais e métodos, 114

Resultados e conclusão, 115

Questões, 116

XX

Outros métodos utilizados para estudo da coagu­la­ção sanguínea, 116

XX

Métodos para investigar distúrbios da hemostasia, 116

Contagem de plaquetas, 117

Tempo de protrombina (TP), 118

Tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA), 119

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108

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

O sangue é um líquido contido em um compartimento fechado, o aparelho circulatório, este o mantém em movimento regular e unidirecional devido às contrações rítmicas do coração.

 

16 - Bioquímica e Biofísica Renal

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16

Bioquímica e

Biofísica Renal

Introdução, 122

XX

Exame de urina, 125

Atividade prática: exame de urina tipo I, 127

XX

Objetivo, 127

Materiais e método, 127

Resultados e conclusão, 128

Questões, 129

XX

Estudo de caso, 129

XX

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122

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

A água, os re­sí­duos do metabolismo e os eletrólitos e não eletrólitos em excesso no meio interno são excretados por meio de um líquido corporal chamado urina. O meio interno é regulado, principalmente, por dois órgãos: os pulmões, que controlam as concentrações de oxigênio e CO2; e os rins, que mantêm a composição química dos líquidos corporais. O equilíbrio dinâmico do meio interno é denominado homeostase. O rim participa da homeostase por meio de três processos:

Filtração. O rim filtra do plasma sanguíneo todas as substâncias de baixa massa molecular, retendo a maioria das pro­teí­nas;

 

17 - Dosagem de Ácido Úrico

PDF Criptografado

17

Dosagem de

Ácido Úrico

Introdução, 132

XX

Atividade prática: dosagem de ácido úrico, 132

XX

Objetivo, 132

Materiais e método, 132

Resultados e conclusão, 134

Valores de referência, 134

Quadros clínicos em que se observa hiperuricemia, 134

Questões, 134

XX

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132

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) possuem bases nitrogenadas de dois tipos: purinas e pirimidinas. As purinas (adenina e guanina) e as pirimidinas (citosina, timina e uracila) são derivadas das nucleopro­teí­nas alimentares (origem exógena) e das nucleopro­teí­nas do metabolismo endógeno.

O ácido úrico é o principal produto do catabolismo das purinas no homem. Sua produção está, portanto, na dependência da alimentação (catabolismo das nucleopro­teí­nas ingeridas), do catabolismo das próprias nucleopro­teí­nas ou, ainda, da transformação direta de nucleotídeos purínicos endógenos (síntese de novo).

 

18 - Dosagem de Bilirrubina

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18

Dosagem de

Bilirrubina

Introdução, 136

XX

Atividade prática: dosagem de bilirrubina, 136

XX

Objetivo, 136

Materiais e método, 136

Resultados e conclusão, 137

Questões, 138

XX

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136

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica

Introdução

XX

A bilirrubina deriva predominantemente da heme da hemoglobina, suprindo cerca de 80 a 85% do pigmento total produzido (em média de 250 a 300 mg de bilirrubina são formadas

24 h a partir de todas as fontes). Os 15 a 20% restantes originam-se do catabolismo de outras pro­teí­nas hemínicas, como a mioglobina, os citocromos e as peroxidases.

A bilirrubina é produzida nas células do sistema re­ticuloendotelial do fígado, baço e medula

óssea. Estas células englobam as hemácias mais velhas, fazendo com que elas sofram lise e liberem a hemoglobina, depois as catabolizam e formam o pigmento.

 

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