Biologia molecular: princípios e prática

Autor(es): Cox, Michael M.
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22 capítulos

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1. O Estudo das Moléculas da Vida

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1

O Estudo das Moléculas da Vida

Momento de descoberta

Uma grande questão acerca da origem da vida diz respeito a como as células primitivas podem ter evoluído. Minha abordagem pessoal a essa questão envolveu muitas discussões com Irene Chen e outros de meu laboratório sobre como vesículas lipídicas contendo RNA, as quais poderiam imitar uma forma simples de vida autorreplicadora, seriam capazes de se dividir. Em outras palavras, à medida que a quantidade de material genético aumentasse por meio da replicação, como o aumento do conteúdo de RNA afetaria as propriedades físicas da vesícula? Previmos que a pressão osmótica poderia provocar o crescimento das vesículas

Jack Szostak [Fonte: Cortesia de Jussi por extração de lipídeos de vesículas vizinhas,

Puikkonen.] fundamentalmente levando à divisão por ruptura e resselagem. Todavia, essa ideia parecia bastante remota, até que Irene começou a fazer experimentos com vesículas contendo lipídeos que portam corantes fluorescentes. Conseguimos encapsular RNA dentro das vesículas e observá-las mudarem de tamanho (ou não) sob diferentes condições ao acompanhar o nível de fluorescência como uma função da área superficial das vesículas. Irene descobriu que vesículas vazias ou “infladas” de RNA eram estáveis ao longo do tempo, mas, quando ela as misturava, as vesículas infladas começavam a crescer, roubando moléculas lipídicas das vesículas vazias vizinhas! Assim, o sistema funcionava exatamente como havíamos imaginado, demonstrando que o crescimento e a divisão de vesículas consistem em um processo que pode ocorrer sem a necessidade de nenhuma função catalítica.

 

2. DNA: O Depósito da Informação Biológica

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DNA: O Depósito da

Informação Biológica

Momento de descoberta

A primeira vez que tive um momento “Aha!” na ciência foi quando eu era um estudante de graduação. A questão que me intrigou estava relacionada com o mecanismo proposto para as topoisomerases, enzimas essenciais que enrolam e desenrolam o DNA durante a síntese deste em todas as células. As enzimas topoisomerases do tipo II (chamadas de Topo II) passam as fitas de DNA uma pela outra, cortando e reunindo o DNA sem marcar ou alterar o genoma. Nos livros-texto, a enzima era apresentada como uma esfera que se ligava a um segmento de DNA, cortava-o e depois se dividia pela

James Berger [Fonte: Cortesia de metade para passar um segundo segmento de

James Berger.]

DNA pela fenda. Mas o que mantinha as extremidades do DNA unidas durante a passagem do DNA duplex pela quebra na dupla fita? Deveria haver mais alguma coisa acontecendo.

Certa vez Francis Crick disse que não podemos compreender como uma enzima funciona a não ser que vejamos a sua estrutura, e eu queria ver a estrutura da Topo II. Passei alguns anos tentando cristalizar a enzima sem sucesso e por fim cheguei ao ponto de duvidar se meu projeto algum dia funcionaria e se eu tinha o que precisava para ser um cientista. Fiz uma última preparação da enzima e, após trabalhar por toda a noite no laboratório, coloquei a enzima purificada no gel e fui para casa dormir. Quando retornei no outro dia, a proteína no tubo estava esbranquiçada, e eu fiquei aniquilado, pensando que a proteína havia precipitado em um agregado sem utilidade. Entretanto, quando observei a amostra sob um microscópio, vi cristais crescendo no tubo! Naquele momento eu sabia que tinha um projeto. Passei os nove meses seguintes resolvendo a estrutura molecular da enzima e nunca me esquecerei da emoção de vê-la pela primeira vez.

 

3. As Bases Químicas das Moléculas Envolvidas no Fluxo de Informações

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As Bases Químicas das

Moléculas Envolvidas no

Fluxo de Informações

Momento de descoberta

Em meados da década de 1980, participei de diversas conferências de química onde estavam em evidência anomalias no comportamento de enzimas as quais não eram consistentes com a maneira que se acreditava que elas funcionassem. Essas anomalias estavam relacionadas com desvios das descrições clássicas das velocidades de reação – um indicativo de que as equações até então existentes para a descrição das velocidades de reação poderiam não ser suficientes para explicar todo o processo. Começamos a imaginar se a canalização de átomos de hidrogênio,

Judith Klinman [Fonte: Cortesia de

Judith Klinman.] um fenômeno quantomecânico de transição por estados de energia proibidos pela física clássica, poderia de fato ter um papel nos mecanismos de reações biológicas. No entanto, imaginava-se que a canalização de átomos ocorresse sobretudo em temperaturas próximas do zero absoluto (0 K), enquanto as reações biológicas ocorrem em aproximadamente 300 K!

 

4. A Estrutura das Proteínas

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A Estrutura das Proteínas

Momento de descoberta

Nunca esquecerei um de nossos primeiros avanços no desenho computacional de proteínas. Nossa proposta era escrever uma descrição matemática da estrutura de proteínas e então otimizar a sua estabilidade termodinâmica por meio de ajustes na sequência de aminoácidos. Até aquele momento, diversos teóricos gabaritados haviam dito que essa tarefa seria impossível, pois a velocidade de enovelamentos das proteínas – sua cinética – também deveria ser considerada.

Destemidamente, iniciamos nosso trabalho demonstrando que regiões estruturais de proteínas poderiam ser designadas por meio de nossos métodos.

Em 1996, tentamos predizer a estrutura de um motivo

Steve Mayo [Fonte: Cortesia de dedo de zinco composto por 20 aminoácidos, um moCaltech.] tivo estrutural característico, que é mantido unido por

íons de zinco. Após várias tentativas, o estudante Bassil Dahiyat finalmente gerou a sequência denominada FSD1, cuja estrutura de dedo de zinco pode ser formada sem a necessidade de nenhum íon de zinco. Ele sintetizou esse peptídeo em nosso laboratório e mais tarde, naquela noite, analisou-o por dicroísmo circular, um método que quantifica a estrutura secundária presente em uma proteína.

 

5. Função Proteica

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Função Proteica

Momento de descoberta

Um dos meus primeiros momentos “eureca” ocorreu durante os anos em que fui professor-assistente. Estávamos estudando em meu laboratório as propriedades de ligação ao DNA da proteína tetramérica de ligação ao DNA de fita simples (SSB, do inglês single-stranded DNA-binding) de Escherichia coli, que é um componente central dos processos de replicação, recombinação e reparo do DNA. Estimativas anteriores do tamanho do seu sítio de oclusão (a extensão de DNA com a qual a proteína interaTim Lohman [Fonte: Cortesia ge diretamente) quando ligado ao DNA de Timothy Lohman.] simples fita variavam de ~30 a 77 nucleotídeos. Não havia consenso para o valor

“correto” e nenhuma explicação do porquê da amplitude desse intervalo de extensão.

Les Overman, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, e eu notamos que o tamanho medido variava tanto com a concentração de sal (p. ex., NaCl) quanto com o tipo de sal, mas atingia um valor limite de ~33 e ~65 nucleotídeos por tetrâmero, em concentrações baixas e altas de sal, respectivamente. Com base nesses experimentos, criamos as hipóteses de que o tetrâmero SSB poderia se ligar ao DNA de fita simples pelo menos de duas maneiras distintas, uma sugestão inédita até aquele momento e que também foi proposta ao mesmo tempo por experimentos independentes realizados no laboratório de Jack Griffith. Recordo da excitação no laboratório quando analisamos nossos resultados, uma vez que eles também explicavam as aparentes discrepâncias no grande volume de dados existentes, provenientes de diversos laboratórios.

 

6. Estrutura do DNA e do RNA

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Estrutura do DNA e do RNA

Momento de descoberta

Logo que iniciei meu laboratório no Whitehead Institute, meu sonho era cristalizar o ribossomo bacteriano e determinar sua estrutura molecular em alta resolução. Embora muito tivesse sido aprendido sobre a estrutura do RNA a partir de estudos com RNAs catalíticos e subunidades individuais dos ribossomos, a possibilidade de visualizar a estrutura completa da maquinaria de síntese proteica era irresistível.

Trabalhando junto com o aluno de graduação Steve Santoso, finalmente obtivemos um pequeno cristal, de aparência perfeita, a partir de uma amostra purificada de ribossoJamie Cate [Fonte: Michael Barnes, UC mo. Levamos o cristal a um feixe de raios X

Berkeley College of Chemistry.] no synchotron e vimos o primeiro padrão de difração indicativo de que o cristal continha mesmo ribossomos. Foi muito emocionante! Para termos certeza, recuperamos o cristal do equipamento de difração de raios X, dissolvemos esse cristal em água e verificamos o conteúdo em gel de agarose – e lá estava o RNA ribossomal, límpido e puro.

 

7. Estudando Genes

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Estudando Genes

Momento de descoberta

Meu laboratório na SUNY Stony Brook estudava a variação genética nos genes ribossomais de camundongos em épocas anteriores ao sequenciamento genômico ou mesmo antes de se poder prontamente sintetizar oligonucleotídeos de DNA. Utilizando o método de Ed Southern para hibridização de fragmentos curtos de DNA com sequências complementares de amostras de DNA genômico, fizemos mapas de restrição enzimática do DNA ribossomal humano e de camundongo.

Norman Arnheim [Fonte: Cortesia da

Meus alunos tomaram emprestado

University of Southern California.] marcadores de tamanho de DNA de fago lambda do meu colega Ken Marcu para usar nos experimentos de Southern blotting com o DNA de camundongo e humano.

Logo começaram a me falar sobre uma determinada sequência de uma sonda da região de um gene ribossomal de camundongo que estava dando sinal em um fragmento de

DNA específico do fago lambda. Ainda posso me ver parado no laboratório, observando aqueles Southern blots mostrarem o fragmento de lambda, mas sabendo que não poderia ser o DNA de lambda que era complementar à sequência do camundongo! Então, o que estava acontecendo?

 

8. Genomas, Transcriptomas e Proteomas

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Genomas, Transcriptomas e Proteomas

Momento de descoberta

Quando o vírus da SARS emergiu como uma nova doença infecciosa, ninguém sabia em um primeiro momento o que causava a infecção. Havia milhares de casos ao redor do mundo, e, como 14% deles eram fatais, tratava-se claramente de uma emergência de saúde pública, sobretudo porque não se sabia naquela época se a infecção poderia ser contida.

Houve dois grandes momentos de descoberta em meu próprio laboratório que se sucederam enquanto trabalhávamos de maneira incessante para identificar o novo agente infeccioso. O primeiro ocorreu quando colocamos amostras de pacientes infectados em nosso ViroChip, que contém fragmentos de sequências de DNA conservadas de todos os tipos conhecidos

Joe DeRisi [Fonte: Cortesia da University of de vírus. Lembro-me de olhar os borrões

California, San Francisco.] iluminarem o escaneador e de podermos ver que este novo vírus tinha sequências similares às dos coronavírus de pássaros, vacas, humanos – tratava-se de algum tipo novo estranho de coronavírus, nunca visto antes!

 

9. Topologia: Deformações Funcionais do DNA

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Topologia: Deformações

Funcionais do DNA

Momento de descoberta

Existia um experimento que eu desejava fazer há muitos anos, mas nunca tinha convencido ninguém a tentar realizá-lo. A ideia era medir diretamente as propriedades elásticas do DNA usando uma única molécula sua presa entre duas ponteiras, de modo que pudesse ser delicadamente controlada pela rotação de uma ponteira com relação à outra para torcer o DNA de diferentes maneiras. Em solução, o DNA pode rotar ao longo do seu eixo e se torcer, enrolando-se ao redor de si.

Pode ser muito difícil desfazer as rotações e torções, medindo as propriedades do DNA em grandes quantidades.

Carlos Bustamante [Fonte: Cortesia de

Após a negativa de muitos estudantes,

Carlos Bustamante.] afinal dois alunos, Zev Bryant e Michael

Stone, ficaram interessados em realizar os experimentos sobre as rotações do DNA. Esses rapazes trabalharam intensivamente na tentativa de estabelecer os aspectos técnicos do experimento. Descobriram como prender as extremidades de um fragmento de DNA a duas ponteiras opostas e associaram pequenas contas facilmente visualizáveis em uma posição no interior da fita dupla de DNA. Por fim, tarde de uma noite, conseguiram fazer tudo funcionar. Zev e

 

10. Nucleossomos, Cromatina e Estrutura Cromossômica

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Nucleossomos, Cromatina e Estrutura Cromossômica

Momento de descoberta

Nossa descoberta do código de posicionamento dos nucleossomos se estendeu por mais de uma década, mas, para mim, houve dois momentos cruciais. O primeiro foi observar que existem sequências preferenciais para a ligação aos nucleossomos, e que isso é uma propriedade intrínseca, e não determinada pela estrutura cromossômica ou por outras proteínas. Em um experimento usando fragmentos aleatórios de DNA para identificar as sequências que são preferencialmente ligadas aos nucleossomos, ficamos surpresos ao descobrir versões exageradas dos mesmos motivos nas sequências que já haviam sido descobertas em nucleossoJonathan Widom [Fonte: Jill Carlson for mos naturais. Esse achado foi publicado há

Martin Woods Image Consulting, LLC.] uma década. Nos anos que se seguiram, resolvemos o problema do alinhamento das sequências dos nucleossomos, mas ainda não entendíamos como essas sequências operavam nos genomas.

Eu estava em um período sabático na Universidade Rockefeller quando conheci

 

11. Replicação do DNA

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Replicação do DNA

Momento de descoberta

Iniciei meu laboratório em Stanford para estudar a recombinação de DNA utilizando os métodos bioquímicos estabelecidos por Arthur Kornberg para o trabalho com a DNA-polimerase. O laboratório de Matt

Meselson em Harvard apresentou evidência de que a recombinação de DNA envolvia a quebra e junção de suas fitas. Partimos, então, para a tentativa de descobrir uma enzima que selasse a quebra do DNA pela formação de uma ponte fosfodiéster.

Usando extratos celulares de E. coli e um substrato de duplex de DNA contendo quebras de fita simples

Robert Lehman [Fonte: marcadas com 32P nas porções 5'-terminais, medimos

Cortesia da American Society for Biochemistry and Molecular a conversão de 5'-32P para uma forma que fosse proBiology.] tegida da remoção por uma enzima, presumivelmente devido à incorporação em uma nova ponte fosfodiéster. Esse ensaio funcionou, e as fitas de DNA foram unidas após incubação do extrato!

No entanto, eu queria obter uma prova definitiva de que as fitas eram unidas por uma ponte fosfodiéster. Apesar de parecer óbvio agora, à época pensamos na possibilidade de que uma proteína ligante fosse a causa da união das fitas de DNA.

 

12. Mutação e Reparo do DNA

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Mutação e Reparo do DNA

Momento de descoberta

Por muitos anos eu e vários outros pesquisadores nos perguntamos como o DNA danificado é replicado nas células, permitindo assim que elas continuem crescendo e tenham a chance de reparar essas lesões. A ideia inicial era a de que proteínas codificadas pelos genes umu poderiam se ligar à DNA-polimerase III — a polimerase replicativa em E. coli — e diminuir sua fidelidade de maneira a permitir a cópia do DNA contendo lesões nos nucleotídeos. A metodologia utilizada em nosso laboratório foi a de

Myron Goodman [Fonte: Cortesia de Myron reconstituir todo o sistema de escape de

Goodman.] lesões por meio de proteínas purificadas.

Colocamos DNA-polimerase III purificada e um DNA com lesão em um tubo de ensaio e começamos a adicionar outras proteínas para ativar o sistema. Primeiramente, adicionamos a proteína RecA, um importante componente das vias de reparo do DNA, mas nada aconteceu. Então, adicionamos um complexo proteico denominado UmuD'2C, que pelo que se pensava atuaria na ativação da polimerase em substratos de DNA danificado, e isso funcionou. O

 

13. Recombinação Homóloga e Reparo do DNA

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Recombinação Homóloga e Reparo do DNA

Momento de descoberta

Recentemente descobrimos como as quebras no DNA de fita dupla (DSBs) são processadas nas células eucarióticas, como um primeiro passo na produção das recombinações meióticas. Essa história teve início alguns anos atrás quando Jack Szostak mostrou que as quebras no DNA de fita dupla estimulam a recombinação homóloga do DNA e atuam como iniciadores naturais para a recombinação meiótica. Os pesquisadores também descobriram que as extremidades do DNA produzidas pelas quebras no de fita dupla sofrem degradação para

Lorraine Symington [Fonte: Cortesia de produzir caudas de fita simples 3', as quais

Lorraine Symington.] são necessárias ao início da recombinação homóloga. Quase ao mesmo tempo, Jim Haber observou que isso ocorria na troca de tipo de acasalamento em leveduras. Mas como são produzidas as caudas de fita simples 3'?

Empregamos estratégias genéticas e bioquímicas por muitos anos com a expectativa de que uma única levedura mutante bloqueasse completamente a formação da cauda

 

14. Recombinação Sítio-específica e Transposição

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Recombinação

Sítio-específica e

Transposição

Momento de descoberta

Entrei na Yale University como pesquisadora de pós-doutorado no laboratório do Dr. Tom

Steitz dez anos após ele e Nigel Grindley terem resolvido a estrutura cristalina do domínio catalítico da resolvase ␥␦, uma recombinase sítio-específica. Meu objetivo era cristalizar um complexo de proteína-DNA para auxiliar na compreensão do mecanismo de recombinação. O sítio de recombinação de

DNA res possui 114 pares de bases de extensão. Contudo, dois sítios res devem estar na forma de DNA supertorcido para que a recombinação ocorra, tornando a cristalização do complexo muito difícil.

Wei Yang [Fonte: Cortesia de Wei Yang.]

No início dos anos de 1990, tivemos de usar a estratégia de “dividir e conquistar”.

Começamos pela cocristalização de DNA contendo apenas um sítio de clivagem res com uma resolvase ␥␦ dimérica. Foi muitíssimo emocionante para mim encontrar os cristais iniciais ao examiná-los com atenção em um microscópio, mas os pós-doutorandos e estudantes experientes do laboratório de Steitz só sorriram e educadamente me desejaram sorte. Compreendi sua gentileza somente depois de descobrir que muitos cocristais de proteína-DNA não difratam raios X, bem ou sob qualquer condição.

 

15. Síntese de RNA Dependente de DNA

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Síntese de RNA

Dependente de DNA

Momento de descoberta

No início da década de 1980, ficou claro que deveriam existir proteínas especializadas na síntese precisa e regulada de mRNAs para determinados genes em células de mamíferos. Entretanto, ninguém havia sido capaz de identificar tais “fatores de transcrição” ou determinar como esse processo de ativação da transcrição atuava.

A descoberta em meu laboratório ocorreu quando constatamos que extratos de células humanas continham um fator capaz de discriminar entre dois moldes e de alguma forma programar a enzima que lê o DNA para escolher o promotor adequado e igRobert Tjian [Fonte: Bonnie Azab/UC norar todos os outros. Mas como?

Berkeley.]

Decidimos usar um pequeno pedaço da sequência de DNA do promotor ativo como “isca” para pescar proteínas que se ligam de maneira seletiva a este sítio. O desafio foi purificar essa atividade entre outras ~3.000 proteínas ligadoras de DNA presentes no extrato de células humanas! Após meses de luta com este problema, lembro-me muito bem de estar entrando no laboratório e ouvindo meus colaboradores, Jim

 

16. Processamento de RNA

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Processamento de RNA

Momento de descoberta

Um dos momentos mais excitantes de que me lembro foi a primeira vez que “vi” os espliceossomos, utilizando microscopia eletrônica. Eu trabalhava já há bastante tempo para purificar espliceossomos, os complexos RNA-proteína que produzem os RNAs mensageiros funcionais por meio da remoção das sequências não codificantes, ou íntrons. Ninguém sabia com o que os espliceossomos se pareciam, e eu esperava utilizar essas amostras para obter as informações estruturais que forneceriam as pistas para o mecanismo de corte e junção do mRNA. Infelizmente, minhas amostras purificadas tendiam a formar agregados quando postas na grade de

Melissa Jurica [Fonte: Cortesia de

Melissa Jurica.] cobre usada para as análises por microscopia eletrônica, tornando as imagens que observei impossíveis de interpretar.

Então, em uma noite, enquanto trabalhava sozinha, desenvolvi algumas micrografias de uma nova amostra de espliceossomo que mostrava partículas individuais que finalmente pareciam macromoléculas — o espliceossomo! Eu estava tão feliz e emocionada a ponto de chorar — mas não havia ninguém por perto para eu mostrar meus resultados! Coloquei o negativo da micrografia na porta de meu orientador, Nico Grigorieff, e quando ele o viu na manhã seguinte nós compartilhamos a alegria dessa descoberta juntos.

 

17. O Código Genético

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17

O Código Genético

Momento de descoberta

A origem da vida tem sido do meu interesse há muito tempo, em particular a evolução dos ácidos nucleicos e a razão pela qual a ribose foi selecionada como o açúcar utilizado no RNA. Na década de 1950, Stanley Miller e outros mostraram que a ribose pode ser produzida de forma abiótica

(sem enzimas), mas observaram que a ribose não

é muito estável. Isso se deve ao fato de a ribose e outros açúcares de cinco carbonos serem sintetizados sob condições alcalinas a partir de precursores orgânicos alcalinos simples, formaldeído e glicoaldeído; um pH alto estimula velocidades de reação razoáveis, mas a ribose tende a se degradar rapidamente em um alcatrão marrom.

Embora não estejamos estudando de fato este determinado problema, o comentário de um colega sobre “resolver o problema da ribose” coincidiu com uma viagem que fiz ao Death

Valley para coletar rochas. Enquanto estive por lá, comecei a refletir sobre as amostras de rochas contendo borato que encontrei e pensei sobre a

 

18. Síntese Proteica

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Síntese Proteica

Momento de descoberta

O momento de definição na minha carreira foi a compreensão de que o RNA ribossomal, e não a proteína, era o componente funcional importante do ribossomo –, e tal descoberta foi um tanto ao acaso. Meu plano, quando comecei meu laboratório na University of

California, Santa Cruz, era aplicar minha formação em bioquímica de proteínas para investigar a função das proteínas ribossomais.

Começamos tratando ribossomos com agentes químicos conhecidos por inativar enzimas proteicas, esperando recuperar ribossomos não funcionais que poderiam ser analisados

Harry Noller [Fonte: Cortesia de para determinar quais proteínas foram afetaHarry Noller.] das e, portanto, descobrir aquelas responsáveis pela atividade. O problema era que o ribossomo resistiu a praticamente todos os tratamentos químicos padrão que tentávamos!

O resultado inesperado de um experimento levou-me a sugerir que um pesquisador em nível de graduação, Brad Chaires, tentasse o reagente específico para RNA cetoxal, que reage com as bases guaninas para produzir adutos que interrompem o pareamento de bases. Para nossa grande surpresa, os ribossomos foram inativados pela modificação de somente seis resíduos de G em mais de 4.000 nucleotídeos no RNA ribossomal.

 

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