Purificação de produtos biotecnológicos

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Vacinas, anticorpos monoclonais, antibióticos, enzimas, polímeros, combustíveis líquidos e gasosos obtidos a partir de biomassa fazem parte da gama de biomoléculas produzidas em células microbianas e animais. A produção se dá em meios líquidos ou sólidos úmidos, fazendo-se necessário, posteriormente, isolar a biomolécula até que ela atinja grau de pureza que a torne adequada para o uso previsto.

Nos 22 capítulos desta obra, os autores, pesquisadores de renomadas instituições de ensino e pesquisa do Brasil, da Argentina, de Portugal e do Peru, abordam de maneira didática parte expressiva das operações unitárias que compõem os processos empregados no isolamento de biomoléculas, nas escalas industrial e laboratorial. Dedica-se um capítulo aos métodos de quantificação e caracterização das biomoléculas e às técnicas para estabilização de enzimas, necessárias à manutenção da atividade dessas proteínas. Moléculas de elevado interesse como anticorpos monoclonais, peptídeos e plasmídeos mereceram capítulos exclusivos. No que tange à forma de condução das operações, foram contempladas a cromatografia multimodal e a aplicação do regime contínuo às operações unitárias quando esse regime apresenta viabilidade operacional. Por fim, e não menos importante, destaca-se a importância didática da obra em vista dos exemplos industriais, exercícios resolvidos e extensa bibliografia.

O público-alvo deste livro são alunos de cursos de graduação em Engenharia Química e de Alimentos, Farmácia-Bioquímica, Química, Engenharia de Bioprocessos, Biotecnologia, Engenharia Bioquímica e Biologia; e pós-graduação em áreas correlatas. Indústrias e laboratórios que atuam na área de biotecnologia também são beneficiados, pois são apresentadas técnicas de uso consagrado e em desenvolvimento.

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CAPÍTULO 1 - Introdução

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CAPÍTULO 1

Introdução

Adalberto Pessoa Jr.

Beatriz Vahan Kilikian

NOMENCLATURA

CPC – Cromatografia de partição centrífuga

EMA – European Medicines Agency

EP – European Pharmacopoeia

FDA – Food and Drug Administration

HGF – Recombinant human hepatocyte growth factor

LLC – Cromatografia líquido-líquido (liquid-liquid chromatography)

LPS – Lipopolissacarídeo mAbs – Anticorpos monoclonais p3HB – Poli-3-hidroxibutirato pHB – Polihidroxibutirato

SUT – Single use technology

Tag – Etiqueta

USP – United States Pharmacopeia

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Purificação de produtos biotecnológicos

LISTA DE PALAVRAS

Agências reguladoras

Anvisa

Atividade biológica

Cromatografia

Custo

DNA circular

Endotoxinas

Estabilização

Estrutura de células

Eucarioto

Farmacopeia

FDA

Impurezas

L-asparaginase

 

CAPÍTULO 2 - Processo de purificação: métodos analíticos e estabilidade de enzimas

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CAPÍTULO 2

Processo de purificação: métodos analíticos e estabilidade de enzimas

Beatriz Vahan Kilikian

Adalberto Pessoa Jr.

Guillermo Alfredo Picó

Mauricio Javier Braia

NOMENCLATURA

η – Porcentagem de recuperação

ΔG – Energia livre de Gibbs

ΔH – Entalpia

ΔS – Entropia a – Atividade enzimática (U)

Ae – Atividade específica (U/L) ou (U/mg)

BCA – Ácido bicincrônico

CX – Concentração da molécula-alvo (mg/L)

CIH – Cromatografia por interação hidrofóbica

RP-HPLC – Cromatografia de adsorção por hidrofobicidade em fase reversa

EC – Eletroforese em zona capilar

ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay

ESI-MS – Electrospray ionization mass spectrometry

FDA – Food and Drug Administration

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Purificação de produtos biotecnológicos

FP – Fator de purificação

EP – European Pharmacopoeia

HPLC – High performance liquid chromatography

 

CAPÍTULO 3 - Rompimento celular

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CAPÍTULO 3

Rompimento celular

Adalberto Pessoa Jr.

Jorge F. B. Pereira

Francislene Andreia Hasmann

NOMENCLATURA

α – Constante de resistência das células ao rompimento

ΔP – Diferença de pressão

μágua (e) – Potencial químico no exterior da célula

μágua (i) – Potencial químico no interior da célula

π – Pressão osmótica transmembranar

L/D – Relações comprimento/diâmetro

B. megaterium – Bacillus megaterium

CTAB – Brometo de cetiltrimetilamónio

D.O. – Densidade ótica

DNA – Ácido desoxirribonucleico (em inglês, deoxyribonycleic acid)

E. coli – Escherichia coli

EDTA – Ácido etilenodiaminotetraacético (em inglês, ethylenediaminetetraacetic acid)

HAP – Homogeneizadores a altas pressões

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Purificação de produtos biotecnológicos

k – Constante de velocidade

N – Número de passagens da suspensão

NaCl – Cloreto de sódio

 

CAPÍTULO 4 - Filtração e centrifugação

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CAPÍTULO 4

Filtração e centrifugação

Beatriz Vahan Kilikian

NOMENCLATURA

α – Resistência específica da torta de filtração

α’ – Constante relacionada ao tamanho e forma das células

Δp – Diferença de pressão

μ – Viscosidade

Σ – Fator que agrega características geométricas e de operação da cen­trifugação

ρL – Densidade do líquido

ρS – Densidade da célula

A – Área de filtração d – Diâmetro da célula

Fc – Múltiplo da aceleração exercida pela gravidade

FRV – Filtro rotativo a vácuo g – Aceleração exercida pela força da gravidade k – Permeabilidade do leito l – Espessura do leito

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Purificação de produtos biotecnológicos

r – Raio da centrífuga

RC – Resistência da torta de filtração

Re – Número de Reynolds

R M – Resistência do meio filtrante s – Compressibilidade da torta t – Tempo de filtração ou centrifugação tf – Tempo de submersão do filtro para FRV v – Velocidade superficial do líquido

 

CAPÍTULO 5 - Processos de separação por membranas

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CAPÍTULO 5

Processos de separação por membranas

Alberto Cláudio Habert

Cristiano Piacsek Borges

Frederico de Araujo Kronemberger

Helen Conceição Ferraz

Ronaldo Nobrega

NOMENCLATURA

αi/j – Seletividade para a mistura i,j

αi/jideal – Seletividade ideal para a mistura i,j

βi – Fator de enriquecimento para o componente i

∆p – Diferença de pressão entre os dois lados da membrana

∆pef – Diferença de pressão efetiva

∆z – Espessura da membrana

Δπ – Diferença de pressão osmótica entre os dois lados da membrana

ε – Porosidade da membrana

µ – Viscosidade do solvente ou da solução que permeia a membrana

µi – Potencial químico da espécie i

π – Pressão osmótica da solução

τ – Tortuosidade dos poros da membrana

∇p – Gradiente de pressão

C – Concentração volumétrica

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Purificação de produtos biotecnológicos

 

CAPÍTULO 6 - Precipitação de proteínas

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CAPÍTULO 6

Precipitação de proteínas

Adalberto Pessoa Jr.

Beatriz Vahan Kilikian

Adriana Célia Lucarini

NOMENCLATURA

β – Constante que representa a solubilidade da proteína quando I é nulo (M)

η – Rendimento aa – Aminoácido

ATP – Adenosina trifosfato

CSTR – Continuous stirred tank reactor – reator contínuo com tanque agitado

E1 – Fração de atividade solúvel no primeiro corte

E2 – Fração de atividade solúvel no segundo corte

FAD – Flavina adenosina dinucleotídeo

FDA – Food and Drug Administration

FP – Fator de purificação

I – Força iônica do meio (M)

KS – Constante de salting-out

NAD – Nicotinamida adenosina dinucleotídeo

NaCl – Cloreto de sódio

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Purificação de produtos biotecnológicos

PAA – Ácido poliacrílico

PEG – Polietilenoglicol

PEI – Polietileno imina

P1 – Fração de proteína total solúvel no primeiro corte

 

CAPÍTULO 7 - Extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas

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CAPÍTULO 7

Extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas

Beatriz Vahan Kilikian

Telma Teixeira Franco

Jane S. R. Coimbra

Antonio J. A. Meirelles

Adalberto Pessoa Jr.

NOMENCLATURA

Dx – Dextrana

EDTA – Ácido etilenodiaminatetracético

IDA – Ácido iminodiacético

K – Coeficiente de partição

NAD – Nicotinamida adenosina dinucleotídeo

NADP – Fosfato de nicotinamida adenosina dinucleotídeo

PEG – Polietilenoglicol

PPG – Polipropilenoglicol

RDC – Coluna de discos rotativos

SDFA – Sistemas de duas fases líquidas imiscíveis

TMA – Trimetilamino

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Purificação de produtos biotecnológicos

LISTA DE PALAVRAS

Afinidade química

Anticorpos monoclonais

Carboximetilcelulose de sódio

Carboximetildextrana de sódio

Carga superficial

Clarificação

Cloreto de tionila

 

CAPÍTULO 8 - Introdução à cromatografia

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CAPÍTULO 8

Introdução à cromatografia

Beatriz Vahan Kilikian

Bibiana Beatriz Nerli

NOMENCLATURA

1/n – Constante experimental da equação de Freundlich

ALE – Adsorção em leito expandido

A1,rup – Área na curva de ruptura que representa a massa de adsorvato perdida até a ruptura

A2, rup – Área na curva de ruptura que representa a massa de adsorvato adsorvida até a ruptura

A3, rup – Área na curva de ruptura que representa a massa de adsorvato adsorvida entre a ruptura e a exaustão do leito

C0 – Concentração do adsorvato na alimentação da coluna

Ceq – Concentração do adsorvato na fase líquida no equilíbrio

CIM – Adsorção em coluna monolítica

HPLC – High performance liquid chromatography, cromatografia de alta eficiência

F – Vazão volumétrica do eluente

HETP – Altura equivalente do estágio teórico hp – Altura do pico cromatográfico

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CAPÍTULO 9 - Cromatografia de exclusão molecular

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CAPÍTULO 9

Cromatografia de exclusão molecular

Ângela Maria Moraes

Paulo de Tarso Vieira e Rosa

Luciana Pellegrini Malpiedi

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA – Ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid)

HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês high performance liquid chromatography)

IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (em inglês, International Union of Pure and Applied Chemistry)

UV – Ultravioleta

NOMENCLATURA

η – Viscosidade intrínseca (mL/g) a – Constante b – Constante erfc – Função erro complementar

Kav – Coeficiente de distribuição ou fração de volume do gel disponível para a difusão de um dado soluto

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Purificação de produtos biotecnológicos

Kd – Coeficiente de distribuição ou fração da fase estacionária disponível para a difusão de uma dada espécie

M – Massa molar (kDa) n – Número de picos que podem ser resolvidos em uma única etapa cromatográfica

 

CAPÍTULO 10 - Cromatografia de troca iônica

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CAPÍTULO 10

Cromatografia de troca iônica

Adalberto Pessoa Jr

Beatriz Farruggia

Fernanda Rodriguez

NOMENCLATURA

AE – Aminoetil

C – Carbóxi

CM – Carboximetil

DEAE – Dietilaminoetil

Hepes – Ácido N-2- piperazina-N’-2 etanossulfônico

Ka – Constante de equilíbrio para a ionização de um ácido

MES – Ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico pI – Ponto isoelétrico

QAE – Dietil-2-hidroxipropil

S – sulfonato

SM – Sulfometil

SP – Sulfopropil

TAM – Trimetilaminometil

TEAE – Trietilaminoetil pKa – -log Ka

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Purificação de produtos biotecnológicos

LISTA DE PALAVRAS

Agarose

Aminas terminais

Ânions,

  fortes

  fracos

Área superficial

Arginina

Biomolécula

Bis-acrilamida

Bolhas

Carboximetil

Carga positiva

Cátions,

  fortes

  fracos

 

CAPÍTULO 11 - Cromatografia de interação hidrofóbica

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CAPÍTULO 11

Cromatografia de interação hidrofóbica

Francisco Maugeri Filho

Marcus Bruno Soares Forte

Oscar Mendieta-Taboada

NOMENCLATURA

1/n – Índice do modelo de Freundlich

∆G – Variação da energia livre de Gibbs (kJ/mol)

∆H – Variação de entalpia (kJ/mol)

∆S – Variação de entropia (kJ/mol.K)

∆t – Intervalo de tempo (min)

η – Porcentagem recuperada de uma molécula (%) a – Atividade enzimática (U)

A – Atividade enzimática volumétrica (U/mL)

A1,rup – Área relacionada à quantidade de adsorvato não adsorvida no recheio

A2,rup – Área relacionada à quantidade adsorvida na coluna

A3,rup – Área relacionada à capacidade não usada da coluna

Abs – Absorbância (UA)

Acol – Área da seção transversal da coluna (cm2)

Ae – Atividade enzimática específica (U/mg)

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Purificação de produtos biotecnológicos

Aeq – Atividade enzimática volumétrica no equilíbrio (U/mL)

 

CAPÍTULO 12 - Cromatografia de afinidade

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CAPÍTULO 12

Cromatografia de afinidade

Gisele Monteiro

Eliana Setsuko Kamimura

Francisco Maugeri Filho

Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela

Paolo Bartolini

NOMENCLATURA

Ab – Anticorpo

Ag – Antígeno

Ab:Ag – Complexo anticorpo-antígeno

[Ab] – Concentração molar do anticorpo no equilíbrio

[Ag] – Concentração molar do antígeno no equilíbrio

[Ab:Ag] – Concentração molar do complexo anticorpo-antígeno no equilíbrio atm – Atmosfera

CNBr – Brometo de cianogênio

DMSO – Dimetil-sulfóxido

DTT – Ditiotreitol

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

Fab – Porção do anticorpo que se liga ao antígeno

Fc – Porção do anticorpo que se liga aos componentes do sistema imune

Fv – Porção variável do anticorpo

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Purificação de produtos biotecnológicos

FPLC – Cromatografia líquida rápida para proteína (do inglês fast protein liquid chromatography) g/mol – Gramas por mol

 

CAPÍTULO 13 - Cromatografia de adsorção em coluna monolítica

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CAPÍTULO 13

Cromatografia de adsorção em coluna monolítica

Daniela Aparecida Marc

Lidija Urbas

Marcel Mafei Serracchiani

ABREVIATURAS

µg – Micrograma

µm – Micrômetro

(NH4)2SO4 – Sulfato de amônio

Ad3 – Adenovírus dodecaedro tipo 3

AU – Unidades de absorbância

Bar – Unidade de pressão

BPF – Boas práticas de fabricação

C4 HLD – Butil com alta densidade de ligante

CaCl2 – Cloreto de cálcio

CDI – Carboxidimidazol

CIM – Meio de interação convectiva (do inglês convective interaction media)

CIMac – Coluna analítica CIM

CIMmultus – Meio de interação convectiva multus

CM – Carboximetil

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Purificação de produtos biotecnológicos

CTI – Coluna de troca iônica

DEAE – Dietilamina

DNA – Ácido desoxirribonucleico

E. coli – Escherichia coli

EDA – Etilenediamina

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

 

CAPÍTULO 14 - Cromatografia: adsorção em leito expandido (ALE)

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CAPÍTULO 14

Cromatografia: adsorção em leito expandido (ALE)

Beatriz Vahan Kilikian

Everaldo Silvino dos Santos

NOMENCLATURA

ε – Porosidade do leito

µ – Viscosidade do fluido (kg/m.s)

σ – Tempo equivalente à metade da distância entre os pontos de leitura 15,85% e

84,15% da absorbância máxima (min)

ρL – Densidade do fluido (kg/m3)

A – Área da seção transversal da coluna (m2)

ALE – Adsorção em leito expandido

CARE – Continuous adsorption recycle extraction (adsorção e extração contínuas sob reciclo)

Daxl – Coeficiente de dispersão axial do fluido (m2/s)

DEAE – Dietil aminoetil dP – Diâmetro da partícula (m)

DTR – Distribuição do tempo de residência

GE – Grau de expansão do leito (%)

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Purificação de produtos biotecnológicos

H – Altura do leito expandido (m)

Ho – Altura do leito empacotado (m)

N – Número de pratos teóricos

 

CAPÍTULO 15 - Cromatografia contínua em leito móvel simulado

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CAPÍTULO 15

Cromatografia contínua em leito móvel simulado

Cesar Costapinto Santana

Diana Cristina Silva de Azevedo

Alirio Egídio Rodrigues

NOMENCLATURA av – Área específica do adsorvente

C – Concentração na fase fluida (kg/m3)

Cent – Concentração à entrada do leito adsorvente

Dax – Coeficiente de dispersão axial (m2/s)

K – Constante de adsorção linear k f – Coeficiente global de transferência de massa (m2/s)

L – Comprimento do leito adsorvente

La – Alfa-lactalbumina

Lg – Beta-lactoglobulina

LMS – Leito móvel simulado

LMV – Leito móvel verdadeiro mj – Razão entre as vazões das fases líquida e sólida numa seção j

M – Massa de adsorvente na coluna

PR – Produtividade (kg soluto/m3 fase estacionária por hora)

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Purificação de produtos biotecnológicos

PU – Pureza (%)

Q – Vazão volumétrica (m3/s) q – Concentração média da fase adsorvida calculada sobre o volume da partícula

 

CAPÍTULO 16 - Cromatografia: ampliação de escala

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CAPÍTULO 16

Cromatografia: ampliação de escala

Adalberto Pessoa Jr.

Beatriz Vahan Kilikian

Diana Romanini

NOMENCLATURA

A – Área de corte transversal da coluna (m2)

AL – Área de corte transversal da coluna em escala de laboratório (m2)

AP – Área de corte transversal da coluna em escala piloto (m2)

BPSS – BioProcess Stainless Steel

C – Comprimento ou diâmetro da extremidade do cone do jato de aspersão (m) cGMP – Good manufacturing practice [boas práticas de fabricação]

CIP – Cleaning in place [limpeza no local] d – Diâmetro da coluna cromatográfica (m) dL – Diâmetro da coluna em escala laboratorial (m) dP – Diâmetro da coluna em escala piloto (m)

E – Espessura da extremidade do cone do jato de aspersão (m)

F – Vazão volumétrica (L/h)

FL – Vazão volumétrica em escala de laboratório (L/h)

Fp – Vazão volumétrica em escala piloto (L/h)

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CAPÍTULO 17 - Cristalização

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CAPÍTULO 17

Cristalização

Roberto Guardani

Marcelo Martins Seckler

Marco Giulietti (in memoriam)

NOMENCLATURA

# – Número de cristais a – Atividade

B – Taxa de nucleação secundária, #.s–1 c – Concentração de soluto na solução, mol.L–1

G – Taxa de crescimento de cristais, m.s–1

G – Energia livre de Gibbs, J/mol

Kef – Coeficiente efetivo de distribuição, definido na Equação 22

L – Tamanho de cristal, m

M – Massa molar, kg.mol–1

MT – Densidade da suspensão, kg.m–3 mc – Massa de cristais, kg

N – Intensidade de agitação

NN – Taxa de nucleação, #.s–1

S – Razão de supersaturação

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Purificação de produtos biotecnológicos

T – Temperatura, K x – Fração molar de soluto na solução

LETRAS GREGAS

µ – Potencial químico, J.mol-1 v – Volume molecular, m-3

ρ – Densidade, kg.m-3

σ – Supersaturação relativa

 

CAPÍTULO 18 - Destilação

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CAPÍTULO 18

Destilação

Maria Elena Santos Taqueda

José Luis Pires Camacho

NOMENCLATURA

α – Uma das fases em uma mistura binária

αAB – Volatilidade relativa

αj,HK – Volatilidade relativa media de cada componente da alimentação, Ki/KHK

β – A outra fase em uma mistura binária

γIV – Coeficiente de atividade da fase vapor

γiL – Coeficiente de atividade da liquida

θ – Raízes da Equação 18.99

µ – Potencial químico

ϕ – Coeficiente de fugacidade

A – Constante da equação de Antoine, Equação 18.23; componente mais volátil de uma mistura binária ai – Atividade do componente i

Ai – Fator de absorção do componente i para misturas multicomponentes

B – Constante da equação de Antoine, Equação 18.23; componente menos volátil de uma mistura binária; vazão molar no fundo da coluna

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Purificação de produtos biotecnológicos

C – Constante da Equação 18.9; constante da equação de Antoine, Equação 18.23

 

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