Ciências Farmacêuticas - Imunoensaios-Fundamentos e Aplicações, 2ª edição

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Na última década, assistiu-se a um impressionante desenvolvimento da biologia molecular. No campo da imunologia, os imunoensaios ocupam papel de destaque, envolvendo a detecção de antígenos, anticorpos e de uma série de moléculas, como peptídios, carboidratos, moléculas complexas e partículas virais. Assim, o emprego dos imunoensaios ampliou-se para acompanhamento terapêutico e screening de diversas substâncias, permitindo sua utilização no controle e no monitoramento de alimentos e de poluentes eventualmente presentes em diversas matrizes biológicas. _x000D_
A segunda edição de Imunoensaios | Fundamentos e Aplicações, ampliada e atualizada, é dividida em duas seções que compreendem essencialmente os fundamentos dos testes de imunoensaios e suas aplicações, especialmente para uso diagnóstico e para estudo de aspectos relacionados à fisiopatologia de um largo espectro de doenças._x000D_
Instrumento importante para todos aqueles que trabalham na área, esta obra possibilita ao leitor não apenas a aquisição de novos conhecimentos, mas principalmente seu aprofundamento._x000D_
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30 capítulos

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1 - Resposta Imune | Aspectos Gerais

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Capítulo 1

Resposta Imune | Aspectos Gerais

Sandra do Lago Moraes

Resposta imune

Quando o ser humano entra em contato com determinados agentes estranhos, como vírus, bactérias, fungos e parasitas, uma sucessão de eventos é desencadeada para eliminá-los, conhecida como resposta imune. O mesmo tipo de resposta pode ser dirigido contra células tumorais ou, ainda, contra proteínas próprias normais, levando à autoimunidade.

O desenvolvimento dos imunoensaios foi possível graças às interações específicas que ocorrem durante a resposta imune.

Na primeira linha de defesa do organismo contra um agente estranho, existem as barreiras físicas e químicas que tentam impedir sua entrada, como a pele e substâncias antimicrobianas produzidas por células epiteliais. Se o agente consegue superá-las, o organismo dispõe ainda de células fagocíticas

(macrófagos e neutrófilos) e células natural killer (NK) capazes de destruí-lo. Também ocorre a ação de proteínas do sangue, como o sistema complemento e outros mediadores de inflamação, além de citocinas que regulam e coordenam a resposta.

 

2 - Imunodiagnóstico | Antígeno, Anticorpo e Interação Antígeno-Anticorpo

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Capítulo 2

Imunodiagnóstico | Antígeno, Anticorpo e

Interação Antígeno-Anticorpo

Irene Fernandes, Noeli Maria Espíndola e Eliana Faquim de Lima Mauro

Conceitos básicos de imunodiagnóstico

Nas últimas décadas, o progresso tecnológico na área da biologia tem permitido o desenvolvimento de métodos capazes de detectar o complexo antígeno-anticorpo (Ag-Ac) com elevada eficiência e confiabilidade.

Além disso, em uma série de moléstias infecciosas, o diagnóstico direto (isolamento, visualização do agente etc.) é por vezes complexo, caro e invasivo e pode ser substituído pelo diagnóstico indireto, utilizando técnicas de detecção de anticorpo ou do complexo Ag-Ac, na medida em que se conhecem os mecanismos imunopatogênicos e a cinética da resposta imune humoral ou a cinética da produção e do metabolismo de antígeno.

O termo imunodiagnóstico vem sendo utilizado para designar o diagnóstico laboratorial feito por meio de técnicas imunológicas que revelam hipersensibilidade a determinados antígenos

 

3 - Tecnologia de Proteínas Recombinantes

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Capítulo 3

Tecnologia de Proteínas Recombinantes

Rosario Dominguez Crespo Hirata e Mario Hiroyuki Hirata

Introdução

A rápida expansão da indústria de biotecnologia tem sido acompanhada de modificações e desafios nos processos de produção eficiente e controlada de proteínas recombinantes em diferentes sistemas para inúmeras finalidades.

A tecnologia de proteínas recombinantes é utilizada para obter e combinar genes de diferentes espécies e expressá-los em vários tipos de hospedeiros. Essa tecnologia possibilita a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes necessárias para fins diagnósticos, terapêuticos e de prevenção de inúmeras doenças humanas.

A escolha do hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes depende principalmente das propriedades e do uso final do produto. A bactéria Escherichia coli e outros sistemas de procariotos têm sido usados com sucesso para a produção de proteínas pequenas (< 30 kDa) e menos complexas.

 

4 - Parâmetros e Qualidade de Imunoensaios

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Capítulo 4

Parâmetros e Qualidade de Imunoensaios

Antonio Walter Ferreira, Sandra do Lago Moraes e Sandra Trevisan Beck

Precisão diagnóstica e valor clínico dos testes de laboratório

Neste capítulo, serão apresentados os parâmetros intrínsecos e extrínsecos de testes de laboratório, sobretudo os imunoensaios,

úteis para a compreensão do valor dos resultados obtidos quando associados a dados clínicos e epidemiológicos do paciente.

O resultado de um teste de laboratório representa uma probabilidade que reflete a situação clínica do paciente no momento da coleta de amostra e, quando bem avaliado, e é uma importante ferramenta de auxílio para o clínico tomar uma decisão ou mudar uma hipótese clínica inicial. Assim, é necessário saber interpretar os resultados em função dos limites do teste utilizado.

Para o clínico, interessa saber com que frequência o teste é positivo em pacientes doentes comparado com a frequência com que resulta negativo nos indivíduos não doentes. Portanto, este capítulo abordará: teste de referência, sensibilidade, especificidade, eficiência, reprodutibilidade, índice kappa, prevalência, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN), teorema de Bayes e probabilidade, curva de característica de operação do receptor (ROC, receiver operating characteristic), taxa de probabilidade (LR, likelihood ratio) e chance (odds).

 

5 - Imunoprecipitação

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Capítulo 5

Imunoprecipitação

Adelaide J. Vaz, Isabel Daufenback Machado e Ednéia Casagranda Bueno

Introdução

Precipitado formado

As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar precipitados resultantes da interação antígeno­ anticorpo, ambos inicialmente solúveis. Nessa técnica, é neces­ sário que a molécula antigênica seja multivalente quanto ao número de epítopos e, de preferência, que os anticorpos sejam policlonais. Para anticorpos monoclonais, a especificidade

única exige que o epítopo esteja acessível e presente em quan­ tidade suficiente na molécula para detecção.

Entre os vários fatores físico-químicos e imunológicos que interferem na quantidade de imunoprecipitado formado, os principais são as concentrações relativas de antígeno e anti­ corpo. O máximo de precipitação é observado quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, dimi­ nuindo na presença de excesso de um ou outro componente.

 

6 - Imunoensaios de Aglutinação

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Capítulo 6

Imunoensaios de Aglutinação

Adelaide J. Vaz, Isabel Daufenback Machado e Ednéia Casagranda Bueno

Introdução

O fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das de precipitação (ver Capítulo 5), diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo às micropartículas insolúveis ou células, o que permite leitura visual e rápida. A técnica não possibilita discriminar frações dos componentes antigênicos como observado na precipitação, mas permite utilizar antígenos purificados ou complexos fixados a micropartículas ou células. Além disso, essa técnica, em especial a de microaglutinação, detecta pequenas quantidades de anticorpos, pois possui maior sensibilidade que a imunoprecipitação.

A característica principal da imunoaglutinação é que um dos componentes, antígeno ou anticorpo, apresenta-se na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células ou adsorvido artificialmente a micropartículas ou células.

O teste de aglutinação ocorre quando há formação de agregados suficientemente grandes de micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos (ou anticorpos), interligados por pontes moleculares de anticorpos (ou antígenos). Para tanto, ocorrem interações entre os sítios combinatórios idênticos dos anticorpos de maneira simultânea com determinantes antigênicos correspondentes. A visualização do imunocomplexo por meio da formação desses agregados pode ser feita a olho nu ou com auxílio de lupa contra luz indireta, em tubo, lâmina ou placa de microcavidade e ocorrer em questão de minutos ou algumas horas.

 

7 - Imunoensaios Utilizando Conjugados

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Capítulo 7

Imunoensaios Utilizando Conjugados

Adelaide J. Vaz, Isabel Daufenback Machado e Ednéia Casagranda Bueno

Introdução

A interação antígeno-anticorpo in vitro nem sempre é evidenciada por um fenômeno visível, como precipitação, aglutinação ou lise celular. O avanço no imunodiagnóstico a partir de

1950 possibilitou identificar antígenos ou anticorpos em testes altamente sensíveis, empregando moléculas marcadas com compostos químicos definidos e detectáveis.

As moléculas ligadas covalentemente aos compostos ligantes são denominadas conjugado, definido como duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas, por exemplo, um conjugado constituído de antígeno marcado com a enzima peroxidase continuará exibindo a antigenicidade original da molécula antigênica e a função da peroxidase de clivar peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio. Essa

é uma das principais características requeridas à obtenção de conjugados, uma vez que moléculas conjugadas que modificam sua função não poderão ser empregadas em imunoensaios.

 

8 - Automação em Imunoensaios

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Capítulo 8

Automação em Imunoensaios

Daniela Crema, Kioko Takei e Regina Ayr Florio da Cunha

Introdução

O remarcável campo dos imunoensaios tem despontado, nos

últimos 60 anos, como um segmento das Análises Clínicas em constante inovação. A fusão da Ciência e da Tecnologia tem permitido grandes avanços nas áreas diagnóstica e de pesquisa.

Uma larga variedade de sistemas de detecção usando marcadores vem sendo, desde há muito, empregada nos testes imunológicos. O primeiro foi o radioimunoensaio (RIE) utilizando 125I, que possibilitou a detecção de certos analitos em pequenas concentrações, por exemplo os hormônios, os quais outrora eram determinados por dosagens complexas, demoradas e muitas vezes imprecisas.

À época, houve um grande desenvolvimento de estratégias para obter testes cada vez mais sensíveis aumentando o sinal ou reduzindo seu background, resultando no aparecimento de kits com essas características para testes in vitro.

Foi exatamente a partir dessa tecnologia, empregando radioisótopos, que se iniciou a automação, por volta do fim da década de 1970.

 

9 - Teste Laboratorial Remoto

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Capítulo 9

Teste Laboratorial Remoto

Alexandre Inácio C. de Paula

Introdução

Teste laboratorial remoto (TLR) é definido como o teste de laboratório clínico realizado próximo ao local de atendimento do paciente e que fornece resultado imediato. Também é chamado de teste de triagem, teste satélite, teste remoto, entre outros.

Cada vez mais frequente em hospitais, ambulatórios e clínicas, trata-se da forma mais rápida de agilizar o resultado, direcionar e permitir terapêutica precoce e eficaz ao paciente, melhorando seu prognóstico.

Apesar de parecer extremamente simples, o TLR não é livremente intercambiável com os testes tradicionais realizados em instrumentos no laboratório clínico. E embora seja de baixo custo, seu uso excessivo e inadequado causa aumentos significativos no custo dos cuidados. Entretanto, evidências científicas mostram que empregar o TLR melhora os resultados das intervenções na saúde quando comparado a não os utilizar. Portanto, são grandes os benefícios ao paciente que sobrepujam os riscos de divergências entre TLR e testes tradicionais. Lembrando que, embora desenvolvido como consequência do aumento da necessidade de resultados clínicos mais rápidos, não deve ser utilizado de forma única ou como substituto do teste tradicional. Suas limitações devem ser consideradas em todas as populações de pacientes. Nesse sentido, é evidente que se devem usar os TLR para triagem, sendo necessários outros exames laboratoriais para confirmação diagnóstica.

 

10 - Desenvolvimento, Produção, Validação e Boas Práticas de Fabricação de Produtos para Diagnóstico In Vitro

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Capítulo 10

Desenvolvimento, Produção, Validação e Boas Práticas de Fabricação de Produtos para Diagnóstico In Vitro

Cláudia Solimeo Meneghisse

Introdução

Em um mundo globalizado, é importante considerar não só a legislação brasileira, mas também a legislação internacional durante o planejamento, o desenvolvimento, a validação e a produção de reagentes para diagnóstico de uso in vitro (IVD, in vitro diagnosis). As boas práticas de fabricação e controle

(BPF) devem ser consideradas desde o início do processo de desenvolvimento, conforme aplicável, para facilitar a implementação durante a produção.

Os produtos para IVD fazem parte de uma categoria conhecida como dispositivos médicos, no Brasil mais conhecidos como produtos para saúde (antigamente chamados de

“correlatos”). Apesar de suas particularidades, os IVD são, em geral, regulamentados como uma subcategoria dos dispositivos médicos, tomando-se essa legislação como base.

A tendência atual na área de dispositivos médicos, incluindo produtos para IVD, é a harmonização da legislação, se não em nível global, pelo menos entre comunidades econômicas. Como exemplo, é possível citar a União Europeia

 

11 - Amostras Utilizadas em Imunoensaios

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Capítulo 11

Amostras Utilizadas em Imunoensaios

Adelaide J. Vaz, Isabel Daufenback Machado e Ednéia Casagranda Bueno

Introdução

normatização na área de laboratório clínico seja internacional.

Por exemplo, algumas instituições envolvidas com esse tema:

A validação dos imunoensaios é feita com base nos parâmetros imunológicos de sensibilidade, especificidade, repetitividade, reprodutibilidade e estabilidade (ver Capítulos 4 e 10). Nesse contexto, apenas os ensaios que apresentam bom desempenho nos parâmetros imunológicos podem estar disponíveis para comercialização. No entanto, não raro, o profissional do laboratório clínico depara-se com resultados não adequados para a amostra em análise. Às vezes, uma nova amostra é coletada e, então, o problema é solucionado.

Assim como em todas as áreas do laboratório clínico, os imunoensaios têm sido objeto de padronização e normatização por vários institutos internacionais de referência em

Análises Clínicas (Clinical Chemistry). Métodos, amostras­ referência, calibradores, normas regulatórias, biossegurança, boas práticas em laboratório e algoritmos para investigação laboratorial são alguns dos principais temas explorados por essas instituições nacionais e internacionais.

 

12 - Metodologia Laboratorial para Estudo da Resposta Imune Adaptativa

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Capítulo 12

Metodologia Laboratorial para Estudo da

Resposta Imune Adaptativa

Anderson de Sá Nunes, Bruna Bizzarro e Denise Morais da Fonseca

Introdução

O sistema imunológico é composto por órgãos, células e moléculas com a função primordial de realizar o reconhecimento do ambiente ao seu redor. Apesar de sua função mais estudada historicamente ser a proteção contra patógenos (bactérias, vírus, fungos, protozoários, helmintos, ectoparasitas, entre outros), atualmente é reconhecido seu papel essencial em processos de manutenção da homeostasia como reparo tecidual e tolerância, que ocorrem de maneira integrada com outros sistemas, como o vascular, o endócrino e o neurológico. O reconhecimento descrito é realizado por uma série de receptores, presentes na forma solúvel em fluidos corporais, na superfície das células e em seu citoplasma. A interação desses receptores com seus ligantes dispara sinalizações moleculares características e cascatas bioquímicas, culminando na produção de mediadores que modulam positiva ou negativamente a atividade celular, levando a um estado de imunidade, hipersensibilidade, regulação ou tolerância.

 

13 - Detecção de Antígenos e Haptenos

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Capítulo 13

Detecção de Antígenos e Haptenos

André Rinaldi Fukushima, Adelaide J. Vaz e Marta Ferreira Bastos

Introdução

Os imunoensaios podem ser aplicados para a identificação e, às vezes, quantificação, de antígenos e anticorpos. O imunodiagnóstico utilizando a pesquisa de anticorpos é bastante utilizado e mostra excelente eficiência no estudo de inúmeras infecções e afecções humanas.

A produção de grande quantidade de anticorpos frente à entrada de substâncias reconhecidas como estranhas pelo organismo é normalmente observada na resposta imune humana e animal. Desse modo, uma vez que os antígenos envolvidos nessa resposta sejam reconhecidos, bem como esteja bem estabelecida a cinética dessa resposta ao longo do tempo nas diferentes fases (aguda, crônica e cura), podem ser implementados testes que consigam detectar anticorpos, inclusive identificando classe e subclasse da imunoglobulina produzida e mensurando a avidez dessa resposta.

Outra opção dos imunoensaios é a pesquisa de antígenos, entendidos como moléculas e haptenos. Como potencialmente qualquer substância pode ser transformada em um imunógeno, podem ser obtidos anticorpos específicos para essa substância. Com esses anticorpos, podem ser padronizados testes para identificar e quantificar essa substância em diferentes tipos de amostras.

 

14 - Proteínas Plasmáticas

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Capítulo 14

Proteínas Plasmáticas

Adelaide J. Vaz e Joilson O. Martins

Introdução

As proteínas plasmáticas e do soro são importantes para o diagnóstico clínico e o monitoramento de doenças e diversas condições clínicas. Por meio da dosagem das proteínas plasmáticas é possível identificar infecções, doenças autoimunes, bem como acompanhar estados inflamatórios. A dificuldade em interpretar as correlações entre as proteínas plasmáticas faz com que haja um diagnóstico equivocado de diversas condições inflamatórias, infecciosas e autoimunes.

Os imunoensaios aplicados para identificar e semiquantificar proteínas foram inicialmente a imunoeletroforese (IEF), ainda nos anos 1950. Os resultados apenas comparavam amostras normais com as amostras em estudo e avaliavam visualmente a intensidade dos arcos de precipitação. A eletroforese demonstrou frações com distintas mobilidades, de acordo com a carga elétrica de seus componentes em pH alcalino: albumina, alfaglobulina, betaglobulina e gamaglobulina, em ordem decrescente de mobilidade. O uso de acetato de celulose como suporte demonstrou que a zona de migração alfa é constituída de duas frações, alfa-1 e alfa-2-globulina. Como as bandas separadas aparecem na forma de áreas ou zonas distintas, essa eletroforese foi chamada de eletroforese de zona.

 

15 - Marcadores Tumorais

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Capítulo 15

Marcadores Tumorais

Adelaide J. Vaz e Karen K. S. Sunahara

Introdução

Marcador tumoral consiste em uma molécula que, independentemente da sua função (enzimática, hormonal, ou não funcional), é produzida por células neoplásicas e secretada nos fluidos biológicos (sangue, líquidos cavitários e de excreção), com capacidade de ser detectada e mensurada por exames não invasivos realizados in vitro. Geralmente, são proteínas ou seus derivados (glicoproteínas, nucleoproteínas, peptídios) que também são produzidos por células do tecido normal, mas em baixas concentrações. O papel dessas moléculas na fisiologia do organismo nem sempre é totalmente esclarecido. Os imunoensaios usados no estudo de marcadores tumorais são preferencialmente realizados com a utilização de anticorpos monoclonais.

Os marcadores tumorais, além de serem detectados nos fluidos biológicos, podem, muitas vezes, ser identificados na membrana das células dos tecidos envolvidos na neoplasia.

 

16 - Infecções Bacterianas

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Capítulo 16

Infecções Bacterianas

Adelaide J. Vaz e Karen K. S. Sunahara

Introdução

Infecção bacteriana e resposta imune

Uma série de microrganismos habita o corpo humano e é benéfica para a manutenção da saúde. Constituída por bactérias e fungos, a microbiota normal tem funções importantes como facilitar o sistema imune na defesa aos patógenos e auxiliar na absorção de nutrientes.

As infecções geralmente ocorrem por um desequilíbrio na interação hospedeiro-patógeno, seja pela incapacidade do organismo em eliminar o patógeno, ou pela alteração topográfica da microbiota normal. Assim, a infecção consiste na invasão e na colonização de tecidos por patógenos que escaparam do mecanismo de defesa natural. De fato, a maioria das bactérias é impedida de infectar o ser humano por barreiras físicas e mecanismos enzimáticos presentes nos tratos respiratório, gastrintestinal e urogenital.

Algumas espécies bacterianas que formam a chamada microbiota normal das mucosas e da pele têm duas funções importantes para o binômio saúde-doença:

 

17 - Infecções Parasitárias

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Capítulo 17

Infecções Parasitárias

Adelaide J. Vaz e Yoshimi Imoto Yamamoto

Introdução

As parasitoses representam importante agravo à saúde em regiões com condições socioeconômico-culturais que permitem a manutenção e a disseminação de vários ciclos biológicos de parasitos. Algumas representam zoonoses, outras são transfusionais, ou ainda, causa de infecção congênita e, por isso, também estudadas em regiões de melhor condição de vida em países desenvolvidos.

A migração das populações humanas e o comércio internacional de alimentos são fatores de introdução de parasitoses em áreas onde antes eram inexistentes. Os métodos laboratoriais de diagnóstico contribuem para:

•• Estabelecer adequadamente a etiologia da infecção para a correta intervenção terapêutica

•• Avaliar a frequência de determinadas parasitoses em diferentes áreas auxiliando no direcionamento de medidas de intervenção local

•• Avaliar a eficiência de medidas profiláticas e terapêuticas ao longo do tempo.

 

18 - Infecções Fúngicas

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Capítulo 18

Infecções Fúngicas

Sandro Rogério de Almeida

Resposta imune contra fungos

O reino Fungi compreende muitas espécies associadas com uma grande variedade de doenças em seres humanos. A relevância clínica das infecções fúngicas (micoses) tem aumentado enormemente nos últimos anos, certamente em decorrência do crescimento no número de indivíduos imunodeficientes, incluindo aqueles infectados com HIV, pacientes transplantados ou com câncer e usuários de imunossupressores (doenças autoimunes).

É conhecido que os mecanismos de defesa do hospedeiro influenciam as manifestações e a gravidade das infecções fúngicas. Em algumas delas, as formas clínicas dependem do tipo e da intensidade da resposta imune do hospedeiro, que, contra fungos, é ampla e vai desde a resposta imune inata até a específica ou adaptativa. A correta integração da resposta imune inata com a adaptativa pode ser fundamental no controle das infecções fúngicas (ver Capítulo 1).

No desenvolvimento da resposta imune adaptativa contra fungos, destaca-se a resposta imune celular como a mais importante no controle da infecção. Por outro lado, a resposta imune humoral ainda é motivo de controvérsia na literatura, e o papel protetor dos anticorpos nas micoses é incerto.

 

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