Biologia molecular - Métodos e interpretação

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Biologia Molecular - Métodos e Interpretaçãofaz parte da série 'Análises Clínicas e Toxicológicas', uma coletânea de livros sobre os métodos empregados para o diagnóstico laboratorial de doenças e a interpretação dos resultados, a fim de garantir qualidade analítica e adequada orientação ao paciente. Esta obra foi idealizada para ser usada por estudantes e profissionais da área de saúde como fonte de pesquisa. Sua leitura permitirá prender, revisar ou aprimorar os conhecimentos sobre as questões analíticas, bem como interpretar seus resultados na área de análises clínicas e toxicológicas. Os principais temas abordados são: hematologia, bioquímica, imunologia, hormônios, citologia, parasitologia, biologia molecular, microbiologia e micologia e toxicologia ocupacional.

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1 - Bases Teóricas para Investigação Laboratorial

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Capítulo 1

Bases Teó ricas para

Investigação Laboratorial

Fernando Luiz Affonso Fonseca

Introdução

Desde a primeira metade do século 19, alguns países europeus e também os EUA começaram a adotar descobertas no campo das ciências e técnicas biomédicas. No decorrer desses 100 anos, o triunfo da clínica, a medicina pré-industrial, o desenvolvimento da medicina laboratorial e experimental e a descoberta do compartimento das células culminaram com o uso da investigação laboratorial e, mais especificamente, dos métodos moleculares para essas investigações.

O triunfo da clínica teve seu início no século 18, quando o médico passou a utilizar o ambiente hospitalar para estudos das doenças (casos clínicos). Esse ambiente ainda é usado como cenário de prática para sua própria formação acadêmica e científica. Contudo, na era pré-industrial, o diagnóstico era realizado pelo

“olhar” clínico singular, ao que se chamava “arte do diagnóstico por excelência”.

 

2 - Amostragem de Material Biológico

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Capítulo 2

Amostragem de Material

Biológico

Monica V. N. Lipay

Introdução

O conhecimento e a apreciação das ferramentas em biologia molecular, que estão em constante desenvolvimento, devem ser incorporados em projetos de estudo e procedimentos laboratoriais. Sob esse aspecto, algumas considerações devem ser feitas para a preparação, a conservação e o armazenamento de amostras biológicas para esses estudos epidemiológicos e de monitoramento.

Apesar da importância da coleta de amostras e da construção de bancos de dados biológicos, pouco tem sido publicado sobre a seleção e a validação dos procedimentos e como eles podem afetar o resultado desses estudos. O objetivo deste capítulo, portanto, é discutir os procedimentos, os desafios e as armadilhas em coleta, processamento e armazenamento de amostras biológicas.

Coleta da amostra

Para uma coleta de amostra confiável e consistente, é essencial estabelecer uma comunicação eficaz entre médicos ou pesquisadores, funcionários e pacientes do estudo.

 

3 - Principais Técnicas Utilizadas em Coletas e Extrações de Ácidos Nucleicos

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Capítulo 3

Principais Técnicas Utilizadas em Coletas e Extrações de

Ácidos Nucleicos

Carolina Tosin Bueno, Paulo Caleb Júnior de Lima Santos

Introdução

A biologia molecular é uma disciplina que colabora no entendimento de várias

áreas, sendo de suma importância para a identificação humana, os diagnósticos moleculares, a investigação das doenças genéticas, os estudos populacionais e o desenvolvimento da medicina terapêutica, preventiva e personalizada. No setor de biologia molecular, além de seguir as boas práticas de laboratório, é importante ter cuidado ao analisar os resultados, de modo que se possa entender exatamente o que eles têm a dizer e alcançar conclusões sólidas.

Este capítulo aborda as técnicas mais utilizadas em coletas e extrações de

ácidos nucleicos, ressaltando que as decisões sobre o tipo de técnica a se escolher e como executá-la dependem dos resultados que se pretende alcançar.

Coleta para extração de DNA e RNA

 

4 - Controle de Qualidade no Laboratório de Biologia Molecular

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Capítulo 4

Controle de Qualidade no

Laboratório de Biologia

Molecular

Monica V. N. Lipay

Introdução

Recentemente, tem-se observado o crescimento explosivo do diagnóstico por técnicas de biologia molecular e a consequente incorporação aos laboratórios clínicos de profissionais oriundos da área de pesquisa. Suas técnicas compreendem importantes ferramentas de diagnóstico pré e pós-natal de anomalias congênitas e de monitoramento de terapia em casos de neoplasias, principalmente hematológicas. A inovação tecnológica oferecida pela reação em cadeia da polimerase (PCR) permitiu ainda que quantidades mínimas das amostras pudessem ser analisadas.

Nos últimos anos, cresceu também o interesse em dados moleculares de doenças genéticas por parte de médicos e profissionais da saúde. O alcance e a precisão dos diagnósticos genéticos trazem responsabilidades clínicas, éticas e legais sem precedentes. Assim, o setor de biologia molecular dos laboratórios deve ter um

 

5 - Reação em Cadeia da Polimerase

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Capítulo 5

Reação em Cadeia da

Polimerase

Bianca Bianco, Fernanda Abani Mafra,

Carla Peluso de Paiva

Introdução

A técnica da reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction – PCR) foi desenvolvida na década de 1980 por Kary Mullis, que recebeu, em 1993, o prêmio Nobel. Essa técnica possibilita a síntese de fragmentos de DNA a partir de sequências-alvo de DNA definidas, capazes de gerar uma quantidade essencialmente ilimitada de uma sequência de interesse, e pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de células.

Para permitir a amplificação seletiva, é necessário desenhar dois oligonucleotídios iniciadores (primers ou amplificadores), os quais são específicos para a sequência-alvo e apresentam cerca de 15 a 25 nucleotídios de extensão. Após os primers terem sido adicionados ao DNA molde desnaturado, eles se ligam especificamente

às sequências de DNA complementares ao seu local-alvo. Esses iniciadores são projetados de modo que um é complementar ao filamento de uma molécula de

 

6 - Desvendando a Técnica de MLPA

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Capítulo 6

Desvendando a

Técnica de MLPA

Denise Maria Christofolini

Introdução

A técnica de MLPA (do inglês multiplex ligation-dependent probe amplification) é uma ferramenta de biologia molecular relativamente nova1 baseada na reação de

PCR (reação em cadeia da polimerase) e utilizada para a detecção de anormalidades genéticas, como aneuploidias, deleções e duplicações gênicas, rearranjos subteloméricos, estado da metilação, entre outras. Essa técnica permite amplificar cerca de 45 sequências de DNA em uma única reação.1

Reação de MLPA

Uma característica típica da técnica de MLPA é que não são as sequências genômicas, mas sim as sondas adicionadas às amostras que são amplificadas. Cada sonda consiste de duas metades, de 20 pb (pares de base) cada, sendo uma sintética e outra derivada de um bacteriófago M13. Essas sondas hibridam em posições adjacentes na sequência-alvo. Uma vez hibridadas, as duas metades são unidas por uma enzima ligase. As sondas possuem uma sequência para um primer universal em sua extremidade (Figura 6.1). Assim, em contraste com a PCR multiplex, um

 

7 - Análise de Proteômica Quantitativa

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Capítulo 7

Análise de Proteômica

Quantitativa

Mariana Ferreira Leal

Introdução

Na última década, foi publicado um número crescente de estudos utilizando as tecnologias de “ômica” (p. ex., genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica), que buscam analisar moléculas em larga escala com o intuito de obter uma visão global de sistemas biológicos.

A maioria das funções biológicas do corpo humano é realizada por proteínas, que são o produto final responsável pelo fenótipo celular, além de serem, atualmente, os principais alvos moleculares de substâncias farmacológicas. O proteoma é dinâmico, e a expressão proteica depende dos mecanismos de controle da transcrição dos mRNA correspondentes e da tradução e regulação da degradação proteica. Assim, o conceito de “um gene, uma proteína” é demasiado simples, pois um RNA pode sofrer recomposição (splicing) alternativa e produzir vários produtos proteicos. Adicionalmente, a atividade proteica depende não somente do nível de expressão, mas também de sua localização e, em muitos casos, de modificações pós-traducionais, como fosforilação, glicosilação, metilação, acetilação, desaminação, ubiquitinação etc. 1 Além disso, algumas proteínas são ativas somente ao interagirem com outras proteínas (Figura 7.1), de modo que a análise de proteômica reflete o estado funcional da célula e adiciona dados únicos que não podem ser observados pelas análises de genômica e de transcriptômica.2

 

8 - Microarrays | Microarranjos de DNA

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Capítulo 8

Microarrays | Microarranjos de DNA

Renata Pellegrino

Introdução

A biologia molecular e a genética são áreas do conhecimento que sofreram grandes e revolucionárias mudanças nas últimas décadas. Tais mudanças estão diretamente relacionadas com os avanços tecnológicos e com a perfeita combinação de ciências exatas, como física, química e matemática, com a biologia e, consequentemente, com a medicina. O Projeto Genoma abriu novas portas para o conhecimento, não somente das sequências de DNA do genoma humano, mas também para a melhor elaboração de ferramentas para validação dessas sequências identificadas.

Por muitos anos, diversas técnicas de biologia molecular surgiram e evoluíram respondendo a cada vez mais perguntas tidas como complexas. Entre esses avanços, a metodologia de microarrays (microarranjos) tem contribuído há mais de duas décadas com a elucidação de várias perguntas biológicas até então não respondidas e é uma das mais poderosas ferramentas usadas em estudos genômicos.

 

9 - Aplicações da PCR e suas Variações na Microbiologia Clínica

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Capítulo 9

Aplicações da PCR e suas Variações na

Microbiologia Clínica

Patricia Xander, Wagner Luiz Batista

Introdução

A detecção, a identificação e a determinação da suscetibilidade a medicamentos constituem a missão primordial dos laboratórios de microbiologia clínica. Além disso, a realização de testes de resistência/suscetibilidade a medicamentos é de fundamental importância para a adequada tomada de decisões antes e durante o tratamento de pacientes. Contudo, pela frequente demora entre a coleta das amostras e o resultado das culturas, muitas vezes o tratamento do paciente é iniciado com antibioticoterapia empírica, pelo menos até a liberação do laudo laboratorial.

Apesar dos esforços que têm sido realizados para o desenvolvimento de métodos de identificação mais rápidos, confiáveis e de adequada relação custo/benefício, atualmente o tempo requerido para identificação dos patógenos, em especial bactérias, tem sido de 24 a 72 h. Nesse sentido, a implantação de métodos moleculares, os quais têm por objetivo captura e/ou amplificação do material genético dos microrganismos, é um campo promissor para a microbiologia clínica, já que essas técnicas são facilmente realizadas, de baixo custo e proporcionam identificação do patógeno de maneira mais rápida que os métodos clássicos ainda hoje utilizados.

 

10 - Aplicações da PCR na Parasitologia

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Capítulo 10

Aplicações da PCR na Parasitologia

Ana Claudia Trocoli Torrecilhas

Introdução

Os diagnósticos parasitológico e imunológico são ensaios para isolar parasitas e detectar anticorpos circulantes nos pacientes infectados. Esses ensaios são muito importantes na identificação dos parasitas e são validados nos laboratórios de referência, porém ainda há muitos problemas na sensibilidade e especificidade desses testes. A grande desvantagem desses ensaios são as reações cruzadas com outra parasitose ou infecção, como o HIV.

O principal foco deste capítulo é mostrar a aplicação da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês, polymerase chain reaction) na identificação dos principais protozoários (apicomplexa) e helmintos causadores de doenças humanas. A PCR tem inúmeras vantagens em relação aos ensaios parasitológicos e imunológicos, mas não se pode invalidar os métodos diagnósticos clássicos. A técnica de PCR é uma ótima ferramenta diagnóstica, mas deve-se levar em consideração a fase da infecção, o sistema de defesa do hospedeiro e o treinamento do pessoal técnico na interpretação dos dados. O desenvolvimento de métodos sensíveis e específicos para detecção de parasitas continua sendo objeto de estudo de vários pesquisadores nos laboratórios de referência nas universidades em todo o mundo.

 

11 - Aplicações da Biologia Molecular em Farmacogenômica

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Capítulo 11

Aplicações da Biologia

Molecular em

Farmacogenômica

Nívea D. Tedeschi Conforti

Introdução

Nem todos os pacientes respondem à terapia medicamentosa de modo uniforme e benéfico. A noção de que variantes genéticas poderiam modular a variabilidade de ação de medicamentos foi proposta pela primeira vez pelo fisiologista inglês

Archibald Garrod, em 1902. Ele sugeriu que os defeitos enzimáticos levariam não só ao acúmulo de substratos endógenos em “erros inatos do metabolismo” (termo criado por ele), mas também ao acúmulo de substratos administrados exogenamente, como medicamentos, alimentos e toxinas, com consequências clínicas. O termo “farmacogenética” foi posteriormente criado por Kalow, em 1959, muito antes de os métodos para estudo da variação da sequência do DNA estarem disponíveis, para descrever o papel da genética na determinação de respostas à medicação que se desviam da norma em relação a eficácia, resultados adversos ou variabilidade da dose.1

 

12 - Aplicações da PCR em Hematologia

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Capítulo 12

Aplicações da PCR em

Hematologia

Paulo Caleb Júnior de Lima Santos,

Paula Fernanda da Silva Fonseca,

Leiliane Rodrigues Marcatto, Carolina Tosin Bueno

Introdução

As aplicações das técnicas de biologia molecular são ferramentas laboratoriais importantes no auxílio diagnóstico de doenças hematológicas e em seu acompanhamento terapêutico. Ao longo deste capítulo, será abordada a detecção de anormalidade genética para diversas doenças hematológicas por diferentes técnicas de biologia molecular.

Genotipagens em hematologia clínica e interpretações

Vários testes e pesquisas genéticas são possíveis em hematologia, sendo considerados importantes ferramentas para o diagnóstico clínico ou diferencial.

A anemia falciforme é uma doença caracterizada pela formação de células falciformes, e a condição homozigótica (HbS/S) causa anemia hemolítica crônica moderada a grave. O diagnóstico pode ser feito por eletroforese de hemoglobina em acetato de celulose e por teste de falcização. No entanto, em alguns casos, pode-se realizar a análise de DNA, por exemplo, para diferenciar HbS/S da HbS/ betatalassemia ou para confirmar a anemia falciforme no pré-natal ou no neonato. A alteração molecular ocorre na posição 6 do gene da globina beta (GAC >

 

13 - Aplicações da Biologia Molecular em Genética de Populações

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Capítulo 13

Aplicações da Biologia

Molecular em Genética de

Populações

Érika Cristina Pavarino, Patrícia Matos Biselli Chicote,

Eny Maria Goloni Bertollo

Introdução

Na década de 1990, os avanços na genética molecular causaram grande impacto na área de genética de populações. O desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR), que amplifica segmentos específicos de DNA, a aplicação de conjuntos de iniciadores evolutivamente conservados para PCR, a utilização dos loci de microssatélites hipervariáveis e o advento do sequenciamento de DNA de rotina em laboratórios foram os mais importantes. Essas inovações, com a evolução de análises precisas e relativamente simples de programas computacionais, permitiram que grande parte dos dados genético-moleculares pudesse ser explorada, revelando informações que, de outra maneira, seriam inalcançáveis.

O destino de uma variante genética no tempo e no espaço é influenciado por fatores biológicos e pelas circunstâncias a que são submetidos os indivíduos, incluindo sucesso reprodutivo, migração, tamanho da população, seleção natural e outros eventos evolutivos. A partir da análise de marcadores genéticos que apresentam certa frequência de alteração, podem ser obtidas informações sobre praticamente qualquer população e sobre os processos evolutivos aos quais foram submetidas. As taxas de variação da distribuição de diferentes marcadores genéticos entre populações variam em virtude da ação diferencial de processos fundamentais, incluindo recombinação e mutação.1

 

14 - Técnicas de FISH e CGH nas Análises Clínicas e Toxicológicas

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Capítulo 14

Técnicas de FISH e CGH nas

Análises Clínicas e

Toxicológicas

Bianca Bianco, Denise Maria Christofolini

Hibridação in situ fluorescente

A citogenética tem sido utilizada para detectar alterações cromossômicas numéricas e estruturais, as quais constituem uma parcela significativa das doenças genéticas, respondendo por parte relevante dos insucessos reprodutivos, das malformações congênitas, da deficiência motora e do atraso intelectual. No entanto, algumas alterações citogenéticas, como rearranjos envolvendo múltiplos cromossomos encontrados em tumores sólidos e leucemias, podem escapar da detecção das técnicas de cariotipagem tradicionais.

Nas últimas duas décadas, observou-se uma explosão de avanços metodológicos nas técnicas de citogenética molecular, que adicionaram cores ao até então mundo preto e branco da citogenética convencional, melhorando o diagnóstico das aberrações cromossômicas. A hibridação in situ por fluorescência (FISH) é uma técnica de citogenética molecular que utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar a presença ou ausência de uma sequência particular de DNA ou para avaliar o número ou a organização de um cromossomo ou de uma região cromossômica. É possível detectar sequências específicas de ácidos nucleicos pela formação de um duplex de um fragmento de ácido nucleico de fita simples modificado (sonda ou probe) e sua sequência complementar (sequênciaalvo) no espécime fixado. A sonda de DNA reconhece e se pareia (hibridação) com sua sequência complementar no cromossomo. Atualmente, como é marcada com um corante fluorescente (fluorocromo), o local em que se hibrida pode ser visualizado ao microscópio de fluorescência (Figura 14.1).

 

15 - Citogenômica Aplicada à Medicina

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Capítulo 15

Citogenômica Aplicada

à Medicina

Monica V. N. Lipay

Introdução

As metodologias de análise do DNA tiveram grande desenvolvimento nos últimos anos, proporcionando um maior detalhamento dos aspectos genéticos da célula e permitindo uma maior compreensão do relacionamento entre o conteúdo genômico e o fenótipo clínico. Desse modo, a triagem de variações na estrutura do

DNA, como deleções, amplificações e rearranjos cromossômicos utilizando técnicas de citogenética molecular, tornou-se ferramenta crucial no diagnóstico de um grande número de doenças.

Como todos os métodos de citogenética molecular têm base na análise da arquitetura genômica, a fusão dos termos “citogenética molecular” e “genômica” resultou na palavra “citogenômica”, que expressa de modo adequado a essência das novas abordagens de estudo do DNA.

Origens na citogenética

A descoberta de que as células humanas apresentavam 46 cromossomos ocorreu em 1956, a partir do trabalho pioneiro de Tjio e Levan em metáfases obtidas em culturas de células embrionárias pulmonares, possibilitado pelo desenvolvimento de métodos de cultura celular, pela utilização da colchicina (substância que impede a formação do fuso mitótico, bloqueando as células em metáfase) e pelo tratamento das células com solução salina hipotônica, que propicia uma melhor dispersão dos cromossomos. A citogenética convencional permitiu os estudos relacionando os defeitos cromossômicos a síndromes já conhecidas anteriormente, como a síndrome de Down, caracterizada pela presença de um cromossomo 21 adicional, ou a síndrome de Turner, com presença de um único cromossomo sexual

 

16 - Terapia Celular

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Capítulo 16

Terapia Celular

Priscila Keiko Matsumoto Martin, Jane Zveiter de Moraes,

Sang Won Han

Introdução

“Aquiles comeu medula óssea de leões para aumentar sua força e bravura”, descreve Homero em seu poema. Na verdade, o conceito de terapia celular vem do antigo Egito (Papiro Ebers) e é utilizado pelos chineses há mais de 3.000 anos.

Já a terapia celular dos tempos modernos foi desenvolvida por acaso pelo médico suíço Paul Niehans, em 1931.1,2 Chamado para intervir em uma situação de emergência, em que uma paciente corria risco de morte por causa de convulsões resultantes de uma ressecção equivocada da paratireoide, o cirurgião Niehans preparou uma solução fisiológica contendo extrato da glândula obtida de vaca e a administrou via intramuscular. Tal procedimento controlou os espasmos, que não voltaram a aparecer durante os 25 anos subsequentes de vida da paciente. Assim,

Niehans estabeleceu um método de tratamento que não era conhecido e conseguiu regenerar um órgão ao usar células jovens de um doador animal.

 

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